乙莫克舍增強順鉑對肺癌細胞系A549的抑制作用

宋明承，劉　妍，赫慧文，陳慧琳，張　晨，陳　翀，羅云萍

(中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 免疫學系， 北京 10005)

肺癌是當今世界嚴重威脅人類健康和生命的惡性腫瘤，也是世界范圍內最常見的人類惡性腫瘤，其發病率和病死率呈逐年上升趨勢。其中非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer, NSCLC)約占肺癌總數的80%～85%[1]。肉堿棕櫚酰基轉移酶Ⅰ(carnitine palmityl transferase 1,CPT1)是脂肪酸氧化的限速酶，位于線粒體內膜的外側。乙莫克舍(etomoxir)是不可逆的CPT1的抑制劑[2]。它與CPT1的催化部位不可逆結合。抑制CPT1活性可上調脂肪酸氧化酶活性。有研究表明etomoxir可以增強細胞的凋亡從而對腫瘤起到抑制作用[3]。最近有研究報道，etomoxir可以明顯抑制MYC高表達的三陰性乳腺癌的生長，然而它對非小細胞肺癌的作用還不清楚[4]。順鉑是一種無機鉑絡合物，在腫瘤細胞中能夠通過形成DNA加合物抑制 DNA合成，順鉑通過與DNA相互作用形成DNA交聯劑誘導細胞毒性，激活多條信號傳導通路, 包括Erk、p53、p73和MAPK,其中對激活凋亡影響最大[5]。目前，順鉑是最廣泛使用的肺癌化療藥物之一。然而，順鉑毒不良反應較大，并且腫瘤細胞容易產生耐藥而導致疾病復發[6]。通過前期實驗發現，敲低CPT1可以促進腫瘤細胞對順鉑的敏感性。本研究的目的是利用CPT1的小分子抑制劑etomoxir，通過影響CPT1活性，進而影響并協同常規化療藥物順鉑，提高腫瘤細胞對該化療藥的敏感性，抑制腫瘤細胞增殖并促進凋亡，從而為提高非小細胞肺癌化療效果提供新的方案。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1細胞系及培養基：A549(人類非小細胞肺癌細胞系，1640培養基，37 ℃、5% CO2培養)(ATCC);RPMI 1640、PBS(中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心)。

1.1.2其他試劑和材料：0.25%胰蛋白酶Trypsin、鏈霉素-青霉素溶液和胎牛血清 (Gibco公司)；Cell Counting Kit-8試劑盒(Bimake公司)；DMSO(Sigma-Aldrich公司)；順鉑和etomoxir(Selleck公司)；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit Ⅰ(BD公司)

1.1.3實驗動物：SPF級周齡為8周的雄性裸鼠20只[中國醫學科學院基礎醫學研究所實驗動物中心SCXK(京)2014-0004]，所有實驗用小鼠質量均為20 g。

1.2　方法

1.2.1細胞增殖測定：在 96孔板中配置 200 μL 的細胞懸液，使細胞數為5 000個/孔。將培養板在培養箱預培養 12 h(37 ℃、5% CO2條件下)；向培養板中加入 10 μL 不同濃度的待測藥物。將培養板在培養箱中避光孵育相應的時間(24、48及72 h)；向每孔中加入 10 μL CCK溶液(避免氣泡產生)；將培養板在培養箱內孵育 0.5～4 h。用酶標儀測定在 450 nm 處的吸光度值，檢測細胞活力。

1.2.2細胞培養及分組處理：A549細胞分為4組：A組為A549細胞中加DMSO培養(對照組)；B組為A549細胞中加etomoxir(75 μmol/L)；C組為A549細胞加順鉑(7.5 μmol/L)；D組為A549細胞加etomoxir和順鉑。培養24 h后如上更換1次培養基，再培養24 h后再次如上更換1次培養基。

1.2.3Transwell細胞遷移實驗：下室加入500 μL 1640培養基(含10% FBS)，上室加入藥物處理72 h后的A549細胞，2.5×105個/孔；培養7 h后終止培養,PBS吹洗2次，棉簽擦去上室內側A549腫瘤細胞，留取外側面遷移下來的A549細胞，將小室浸于4%多聚甲醛固定10 min，0.1%結晶紫染色20 min，棉簽再次擦去上室內側壁雜色，清水反復清洗5次，鏡下觀察遷移至外側面的A549細胞并拍照，隨機選取5個視野計數。

1.2.4流式細胞計量術：吸取PBS將已經過藥物處理72 h的各組A549細胞倒掉液體，用PBS洗滌2次，胰蛋白酶消化5 min,2 000 r/min離心5 min，收集各組A549細胞，按試劑盒說明加入試劑盒內試劑，以重懸細胞，將其吸入離心管中備用；采用annexin V-FITC/PI雙染法，將5 μL annexin V和5 μL PI混勻后加入樣品中，避光常溫孵育15 min；再按試劑盒說明加入盒內試劑，把細胞吹打混懸，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率；實驗重復3次，結果數據分析用Flowjo軟件分析。

1.2.5動物實驗：將小鼠隨機分為4組，每組6只。第一天給所有小鼠(部位)接種100 μL(5×106個/mL)A549細胞。從第14天開始給藥治療(腹腔注射)，每周給藥2次，同時測量小鼠體質量及瘤體大小。給藥方案如下：A組每只小鼠注射200 μL PBS；B組每只小鼠注射200 μL順鉑(5 mg/kg)溶液；C組每只小鼠注射200 μL etomoxir(20 mg/kg)溶液；D組每只小鼠注射200 μL 順鉑(5 mg/kg)與etomoxir(20 mg/kg)混合藥物溶液。經3周治療后，斷頸處死小鼠并取腫瘤與肺組織，稱重并拍照，其后用4%多聚甲醛固定保存組織。

1.3　統計學分析

2　結果

2.1　Etomoxir與順鉑的藥物工作濃度測定

隨著藥物濃度的增加，A549細胞活力逐漸降低(P<0.05)(圖1A)，選取順鉑7.5 μmol/L作為后續實驗藥物使用濃度；用不同濃度的etomoxir處理細胞72 h，隨著藥物濃度的增加，A549細胞活力逐漸降低(P<0.05)(圖1B)，選取etomoxir 75 μmol/L作為后續實驗藥物使用濃度。

2.2　經etomoxir與順鉑藥物聯用腫瘤細胞增殖受到明顯抑制

與對照組相比，順鉑處理細胞后細胞活力下降(P<0.05)；與etomoxir處理組相比，順鉑聯合etomoxir處理細胞后細胞活力明顯下降，(P<0.001)；與順鉑處理組相比順鉑聯合etomoxir處理細胞后細胞活力明顯下降(P<0.001)(圖2)。

A.toxicity of cisplatin to A549 cells,*P<0.05 compared with control group(0 μmol/L cisplatin)；B.toxicity of etomoxir to A549 cells;*P<0.05 compared with control group(0 μmol/L etomoxir)

圖1不同濃度順鉑或etomoxir處理肺癌A549細胞72h對其增殖影響

*P<0.05,**P<0.001 compared with etomoxir, △P<0.001 compared with cisplatin圖2　不同藥物處理肺癌細胞A549 72 h對其增殖影響Fig 2　Effects of different drug on cell growth of A549

2.3　經etomoxir與順鉑藥物聯用腫瘤細胞的遷移能力明顯受到抑制

經藥物處理72 h后，對處理細胞進行Transwell實驗。與對照組和單用etomoxir及單用順鉑組相比，順鉑聯用etomoxir可降低腫瘤細胞的遷移能力(圖3)。

2.4　Etomoxir與順鉑藥物聯用促進腫瘤細胞凋亡

經藥物處理72 h后，順鉑組較對照組增殖抑制率有升高(P<0.05); 順鉑聯合etomoxir組增殖抑制率較順鉑組明顯升高(P<0.001); 較etomoxir組有明顯升高(P<0.0001)(圖4)。與對照組相比，順鉑組細胞凋亡率增加(P<0.05)；順鉑聯合etomoxir組較順鉑組促進A549細胞凋亡的作用更加明顯(圖4)。

A.control group; B.etomoxir group; C.cisplatin group; D.cisplatin+etomoxir group; E.number of migration cells；*P<0.0001 compared with etomoxir；△P<0.0001 compared with cisplatin

A.control group; B.etomoxir group; C.cisplatin group; D.cisplatin+etomoxir group; E.apoptotic index(AI%)；#P<0.05 compared with control；*P<0.001 compared with etomoxir；△P<0.0001 compared with cisplatin

2.5　順鉑聯合etomoxir在小鼠荷瘤實驗中對肺癌腫瘤的治療效果

順鉑聯合etomoxir治療組的腫瘤體積均明顯小于對照組、單用etomoxir治療組和單用順鉑治療組，實驗結果有統計學意義(P<0.05)(圖5)。在小鼠荷瘤實驗中可以看出經過順鉑聯用etomoxir藥物治療后，小鼠的腫瘤生長受到明顯的抑制。

3　討論

目前認為腫瘤發生發展是多因素多階段發展的動態過程，由腫瘤本身及腫瘤與腫瘤微環境之間多種相互作用共同影響[7]。脂肪酸參與了腫瘤細胞的多個生物學過程：首先，脂肪酸參與細胞膜重要構成分子的合成，故腫瘤細胞的快速增殖有賴于大量的脂肪酸[8]；其次，在許多類型的腫瘤中，脂肪酸的β-氧化是腫瘤細胞的重要功能方式[9]。另外，多種研究表明，在多種腫瘤中，脂肪酸代謝途徑的關鍵基因通過調控其相關代謝酶的表達進而影響腫瘤的生長[10-12]。CPT1作為細胞內脂肪酸代謝的關鍵酶參與脂肪酸代謝過程，具有重要生物學意義[3]。本課題組前期工作發現：將腫瘤細胞的CPT1基因敲低后，腫瘤增殖受到抑制，同時促進腫瘤細胞的凋亡。Etomoxir作為CPT1的不可逆抑制劑，抑制CPT1活性。順鉑雖然作為肺癌化療的重要化療藥，但由于其存在一定的毒副作用，特別是其耐藥的發生嚴重影響順鉑的臨床療效。本實驗證實了相較于單獨使用藥物順鉑或etomoxir，順鉑在聯合了CPT1抑制劑etomoxir后，使非小細胞肺癌細胞系A549的增殖受到更為明顯的抑制，同時還促進了該腫瘤細胞系的凋亡。不僅如此，對腫瘤細胞系A549細胞的遷移作用也有明顯的抑制。小鼠體內實驗發現，順鉑與etomoxir的聯合用藥可以明顯抑制腫瘤的生長。這說明可以通過CPT1的小分子抑制劑etomoxir與順鉑聯合用藥增強化療藥順鉑對腫瘤細胞的抑制作用。其機制可能是etomoxir通過對CPT1的抑制作用使腫瘤微環境中脂肪酸的氧化能力降低，造成脂肪酸利用下降，使腫瘤細胞能量供應不足，造成DNA合成能量不足；同時順鉑在腫瘤細胞中通過形成DNA加合物抑制DNA的合成。故etomoxir可以協同順鉑作用，使順鉑對腫瘤細胞的抑制作用增強，為臨床非小細胞肺癌化療方案提供新的思路。

A.image of mouse tumors at the 31st day after bearing tumor cells； B.tumor volume comparison of mouse lung cancer between different treatment groups;*P<0.05 compared with cisplatin group；#P<0.05 compared with etomoxir group