蝸牛酶輔助提取石榴皮原花青素的響應面優化

劉顯明，顧焰波，陳冬年，王翼，王華

（南京理工大學泰州科技學院 環境與制藥工程學院，江蘇 泰州 225300）

原花青素是一類黃烷醇單體及其聚合體的多酚類化合物，又稱聚黃烷醇類多酚，前者為黃烷－4－醇或黃烷－3，4－二醇，后者則為縮合單寧和酚酸，廣泛存在于各類植物中［1］，且存在于日常生活的許多食品中，如紅酒等。許多食源性的原花青素在日常生活中被人們攝取，且具有較好的生物活性，原花青素具有抗氧化、清除自由基、防治心血管疾病、抗炎、防癌抗癌等功能［2－6］。目前，原花青素在食品、藥品、保健食品等領域應用廣泛，作為天然食源性防腐劑，主要用于延長食品的保質期，可消除人工合成防腐劑帶來的安全風險，并對人體健康具有重要作用；作為食品調料，廣泛用于各種日常食品如奶酪、蛋糕等以及飲料、酒中，可提升食品的營養保健功能。新鮮石榴皮中黃酮含量較高，約為6%，原花青素為其主要的黃酮化合物成分［7，8］，合理利用可變廢為寶，故其分離純化技術也越來越受到重視。

目前，植物中原花青素的提取工藝主要有傳統溶劑提取法［9］、微波和超聲波輔助法［10］、酶法輔助提取［11］等，酶法提取利用酶對植物細胞壁進行降解和破壞，可增加細胞內容物的溶出，提高有效成分的提取效率。本試驗采用蝸牛酶輔助從石榴皮中提取原花青素，并通過BBD設計試驗優化其工藝條件，將會給石榴皮綜合利用提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴（購于當地超市，產地泰州）；蝸牛酶（破壁率可達90%以上）；其他生化試劑（上海金穗生物科技有限公司）；其他實驗試劑（均為市售分析純）。

pHS－3C酸度計 上海精密科學儀器有限公司；RE－52旋轉蒸發儀 上海研承儀器有限公司；SHB－Ⅲ真空泵 鄭州長城儀器有限公司；DHG－9202－3SA電熱鼓風干燥箱 上海三發科學儀器有限公司；XFB－200微型高速粉碎機 湖南吉首中誠制藥機械廠；UV754N紫外－可見分光光度計 上海精科儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 石榴皮預處理

將新鮮石榴洗干凈、手工剝皮，將石榴皮放入烘箱中，設定溫度60℃、烘干12h。取出之后用微型高速粉碎機粉碎［12］，過40目篩子，所得粉末狀經50～70℃的烘箱中干燥，粉末密封保存在白色塑料袋里備用。

1.2.2 標準曲線的繪制

本試驗采用正丁醇－鹽酸法測定原花青素的含量，參考文獻［13］，記錄試驗數據并繪制出原花青素標準曲線。

1.2.3 原花青素的提取

參考文獻［14］，稱取一定量的備用石榴皮粉末置于圓底燒瓶中，在一定的酶用量（%，下同）下，加入一定pH的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液、搖勻，于水浴鍋中加熱攪拌一定時間后趁熱過濾、收集濾液。回收濾渣并加入100mL 70%乙醇，80℃條件下提取30min后趁熱過濾，分離并保留濾液，所得濾渣重復上一次操作，合并所有濾液并再次過濾、收集濾液，濾液經旋轉蒸發后（50℃），得到原花青素濃縮液。用甲醇將其定容至50mL容量瓶中，在3500r/min下離心10min，移取1mL上層清液按照原花青素標準曲線繪制方法測定其吸光度值，記錄并處理實驗數據。

1.2.4 原花青素得率的計算

式中：V為濃縮液定容后的體積（mL）；C為濃縮液中原花青素的含量（mg/mL）；M為石榴皮粉末質量（g）。根據原花青素含量與吸光度值之間的一元線性回歸方程可得出原花青素的含量，進而計算出得率。

1.2.5 單因素試驗

在固定其他因素相同的條件下，分別考察各單因素：酶用量（%）、提取時間（min）、提取溫度（℃）和pH值對得率的影響。

1.2.6 響應曲面法優化原花青素提取條件

以酶用量（%）、提取時間（min）、提取溫度（℃）和pH值為單因素試驗考察變量，依據BBD試驗設計原理，以原花青素得率為優化響應值，采用四因素三水平的響應面分析法優化提取條件，因素水平安排見表1。

表1 響應面試驗因素水平表

2 結果與分析

2.1 原花青素標準曲線的繪制

以吸光度（A550）為縱坐標，原花青素濃度（C）為橫坐標，繪制曲線。

圖1 原花表素標準曲線

由圖1可知，原花青素的濃度與吸光度值之間的一元線性回歸方程為：Y＝0.03745＋2.17233X，R2＝0.9997。結果表明：采用1.2.2的方法測得的原青花素濃度在30～300μg/mL范圍內具有較好的線性關系。

2.2 單因素試驗

準確稱取備用的石榴皮粉末3.000g進行下列單因素試驗。

2.2.1 酶用量對得率的影響

提取溫度為50℃，pH值為5.0，提取時間為90min，結果見圖2。

圖2 酶用量對原花青素得率的影響

由圖2可知，隨著酶用量的增多，原花青素得率也逐漸增大，當酶用量為1.0%時得率最大；隨后原花青素的得率隨著酶用量增加而下降。其原因可能是酶用量較低時，酶與底物結合較充分，細胞壁與細胞間的果膠物質水解程度大，進而溶出原花青素。當酶用量大于1.0%時，底物濃度不能使酶達到飽和，從而抑制酶水解果膠成分使原花青素的提取效果下降［15］。因此，酶用量以1.0%為宜。

2.2.2 pH值對得率的影響

提取溫度為50℃，酶用量為1.0%，提取時間為90min，結果見圖3。

圖3 pH對原花青素得率的影響

由圖3可知，隨著緩沖液pH值升高，原花青素得率也升高，pH值為5.0時得率最大，pH值過高得率反而下降。其原因可能是pH值過高蝸牛酶的生物活性受到一定抑制作用，不利于提取。因此，本試驗選擇pH值5.0左右為宜。

2.2.3 提取溫度對得率的影響

pH值為5.0，酶用量為1.0%，提取時間為90min，結果見圖4。

圖4 提取溫度對得率的影響

由圖4可知，溫度小于50℃時，原花青素得率隨著溫度的升高而增大，50℃時得率達到最大值，繼續升高溫度后呈現下降趨勢。其原因可能是在50℃前隨著溫度的升高果膠物質水解程度增大，反應速率較快，使酶水解反應較強，原花青素得率不斷增加；溫度超過50℃時維系酶空間結構的非共價鍵斷裂，部分蝸牛酶失去活性，水解程度降低，得率下降。因此，提取溫度50℃為宜。

2.2.4 提取時間對得率的影響

pH值為5.0，酶用量為1.0%，提取溫度為50℃，結果見圖5。

圖5 提取時間對原花青素得率的影響

由圖5可知，隨著提取時間的延長，原花青素得率呈現上升趨勢，90min時達到最大，繼續延長提取時間得率不升反降。這可能是由于原花青素屬于多酚類化合物，延長提取時間會使原花青素的穩定性下降，原花青素得率進而下降，因此，提取時間90min為宜。

2.3 響應面分析試驗

2.3.1 試驗設計及結果

根據單因素試驗結果，試驗設計及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果

通過Design Expert軟件，建立以原花青素得率為響應值的回歸模型：

2.3.2 響應面優化結果分析

BBD試驗設計回歸模型分析結果見表3。

表3 回歸模型結果分析

由表3可知，模型的p＜0.0001，說明式（2）中回歸方差的關系是顯著的；失擬項的p值為0.2714＞0.05，說明所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小，式（2）回歸方程的關系是好的；其R2＝0.9374，表明此模型擬合度較好；回歸模型一次項A，B，D對原花青素得率影響極顯著，一次項C影響不顯著，二次項BD，CD，A2，B2，C2影響極顯著，交互項AB影響顯著，其余不顯著，說明各因素對響應值的影響比較復雜，并非簡單的線性關系，各因素對原花青素得率的影響次序為：A＞D＞B＞C。

響應曲面圖見圖6～圖11。

圖6 Y＝（A，B）的響應圖面

圖7 Y＝（A，C）的響應圖面

圖8 Y＝（A，D）的響應圖面

圖9 Y＝（B，C）的響應圖面

圖10 Y＝（B，D）的響應圖面

圖11 Y＝（C，D）的響應圖面

由圖6～圖11可知，響應中心位于所考察區域內，且響應曲面坡度越陡，則響應值對試驗條件的改變越敏感，說明在考察區域范圍內存在最大響應值。試驗設計條件下得出原花青素提取的最佳工藝為：pH值5.0、提取溫度51.58℃、酶用量0.982%、提取時間95.19min，原花青素得率為0.692%。考慮到實際操作條件，在如下條件下進行3次平行試驗：提取溫度50℃、pH值5.0、提取時間90min、酶用量1.0%，原花青素得率為0.658%。

3 結論

本試驗采用蝸牛酶輔助提取石榴皮中的原花青素，在單因素試驗基礎上采用響應曲面法優化提取工藝。試驗結果表明：采用響應曲面法優化所得到的試驗模型擬合度良好，具有一定的實際應用和研究參考價值，結合試驗實際操作條件，其響應面優化的提取工藝參數為：酶解溫度50℃、pH值5.0、提取時間90min、酶用量1.0%，原花青素得率為0.658%。