鳥苷酸發酵工藝優化

劉晨，丁長河＊，金少舉，陳復生，杜娟

（1.河南工業大學 食品學院，鄭州 450001；2.河南省南街村（集團）有限公司，河南 漯河 462000）

鳥苷酸作為組成核酸的5種核苷酸之一，具有獨特的香菇樣鮮味，因其鮮味閾值達到0.0125g/dL，常被用于增強食品的鮮味［1］。在食品工業中主要以其鈉鹽（鳥苷酸二鈉）的形式作為食品添加劑，用作調味料、醬油、味精的原料，通常與谷氨酸鹽一起用于增強食品的鮮味［2］。在醫藥領域，鳥苷酸具有高度的生物活性，可以提高機體免疫力、輔助抗腫瘤、促進生長以及調節機體營養代謝，能夠促進肝功能恢復、調節機體免疫功能、抗癌等［3－6］，使鳥苷酸成為極具開發潛質的醫藥原料。此外，鳥苷酸具有的抗氧化活性，對神經的生長影響非常大［7－10］，可以保護細胞免受活性自由基的侵害。鳥苷酸在食品以及藥品工業中都起著不可估量的作用。

鳥苷酸的生產方法有酶水解RNA法、菌體自溶法、發酵法和化學合成法4種方法。鳥苷酸生產工藝目前運用最廣泛的是發酵轉化法，利用一定微生物，以葡萄糖作為碳源生產鳥苷，再利用生物或化學方法將其轉化為鳥苷酸，如鳥苷磷酸化得鳥苷酸，且工業化生產鳥苷酸的方法就是采用鳥苷發酵的二步生產法［11，12］。

目前，我國鳥苷酸發酵得率較國外先進水平低，鳥苷酸工業化生產還未成熟，如何提高鳥苷酸產量成為研究的重中之重。本文研究發酵培養基配方及發酵條件對鳥苷產量的影響，通過單因素試驗及正交試驗對發酵培養基的組成及發酵條件進行優化［13，14］，得到最佳發酵工藝，提高鳥苷酸發酵得率。

1 試驗材料

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）變異菌株：由河南省南街村（集團）有限公司提供。

1.2 培養基

1.2.1 斜面培養基（%）

蛋白胨1.0；氯化鈉0.5；牛肉膏粉0.3；瓊脂1.5。

1.2.2 種子培養基（%）

蛋白胨1.0；牛肉膏0.3；氯化鈉0.5。

1.2.3 發酵培養基（%）

葡萄糖12.0；酵母粉1.6；玉米漿0.2；谷氨酸鈉1.0；磷酸氫二鉀0.2；氯化鈣0.2；碳酸鈣2.0；硫酸銨2.0；硫酸鎂0.05。

1.3 主要試劑

葡萄糖（AR）、硫酸鎂（AR）、碳酸鈣（AR）、氯化鈣（AR）、磷酸氫二鉀（AR）、硫酸銨（AR）、氫氧化鈉（AR）、氯化鈉（AR）、乙腈（HPLC）：天津市科密歐化學試劑有限公司；谷氨酸鈉（BR）：Solarbio公司；酵母浸粉（BR）、牛肉膏（BR）、蛋白胨（BR）、營養瓊脂（BR）：北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.4 主要儀器

高效 液 相 色 譜 儀 （Agilent Technologies 1260 Infinity） 安捷倫科技公司；電熱恒溫培養箱（DNP－9052） 上海精宏實驗設備有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌器（DSX－280B） 上海申安醫療器械廠；單人單面凈化工作臺（SW－CJ－1FD） 蘇州凈化設備有限公司；臺式低速離心機（TDL－5A） 金壇市醫療儀器廠；漩渦振蕩器（UVS－1） 北京優晟聯合科技有限公司；電子萬用爐（DL－1） 北京市永光明醫療儀器有限公司；數顯氣浴恒溫振蕩器（SHZ－2A） 金壇華峰儀器有限公司；電子天平（JY5002） 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DK－98－Ⅱ） 天津市泰斯特儀器有限公司。

2 試驗方法

2.1 菌種活化

菌種定期活化，取斜面保藏菌種劃線接種于活化斜面，置于恒溫培養箱中36℃恒溫靜置培養24h。

2.2 搖瓶種子培養

在500mL三角瓶中加入50mL種子培養基，8層紗布封口，置于高壓滅菌鍋中在121℃下滅菌15min，在恒溫水浴鍋中恒溫至36℃，接種1環或2環斜面保存菌種，36℃，100r/min，在恒溫振蕩培養箱中培養12～15h。

2.3 發酵培養

在500mL三角瓶中加入27mL種子培養基，8層紗布封口，置于高壓滅菌鍋中在121℃下滅菌15min，在恒溫水浴鍋中恒溫至36℃，接種種子液3mL，36℃，110r/min，在恒溫振蕩培養箱中培養72h。

2.4 正交試驗設計

將發酵培養基中葡萄糖、酵母粉、玉米漿、谷氨酸鈉等成分及發酵條件如溫度、發酵時間、pH等進行單因素試驗，再選取對鳥苷產量有顯著性影響的單因素，考慮因素間交互作用進行三因素三水平正交試驗。

2.5 發酵樣品預處理

準確吸取發酵樣品0.1mL于10mL離心管中，用4mol/L NaOH 定容至10mL，混合均勻，沸水浴5min，再以3000r/min離心5min。取離心后上清液1mL，稀釋定容至100mL，供測定。采用高效液相色譜法測定發酵液中的鳥苷含量，柱子：C18，流動相：乙腈∶水為10∶90，流速：1mL/min，檢測波長：256nm，柱溫：25℃，進樣量：10μL［15］。

3 結果和討論

3.1 發酵培養基對鳥苷產量的影響

3.1.1 葡萄糖濃度對鳥苷產量的影響

選取葡萄糖濃度8%，10%，12%，14%，16%5個水平，在發酵條件為菌種培養時間12h、接種量10%、發酵時間72h、發酵液pH 7.0、發酵溫度36℃時，葡萄糖濃度與鳥苷產量關系見圖1。

圖1 葡萄糖濃度與鳥苷產量關系Fig.1The relationship between the concentration of glucose and the yield of vernine

由圖1可知，當葡萄糖濃度為12%時，鳥苷產量最高，達到7.6g/L。顯著性分析表明：葡萄糖濃度為12%時鳥苷產量與8%，14%，16%3組之間存在極顯著性差異（P＜0.01），與葡萄糖濃度10%組之間存在顯著性差異（P＜0.05），葡萄糖濃度對鳥苷產量有顯著性影響。

3.1.2 酵母粉濃度對鳥苷產量的影響

發酵條件同3.1.1，葡萄糖濃度為12%，選取酵母粉濃度為1.2%，1.6%，2.0%，2.4%，2.8%5個水平進行鳥苷發酵，酵母粉濃度與鳥苷產量關系見圖2。

圖2 酵母粉濃度與鳥苷產量關系Fig.2The relationship between the concentration of yeast powder and the yield of vernine

由圖2可知，在酵母粉濃度為1.6%時，鳥苷產量最高，達到6.5g/L。顯著性分析表明：酵母粉濃度為1.6% 時鳥苷產量與1.2%，2.0%，2.4%，2.8%4組之間均存在極顯著性差異（P＜0.01），鳥苷產量呈現先上升后下降的趨勢；酵母粉濃度達1.6%之后，隨著酵母粉含量增加，反而對鳥苷發酵有抑制作用。

3.1.3 玉米漿粉濃度對鳥苷產量的影響

發酵條件同3.1.1，葡萄糖濃度為12%，酵母粉濃度為1.6%，選取玉米漿粉濃度0.1%，0.15%，0.2%，0.25%，0.3%5個水平，玉米漿粉濃度與鳥苷產量關系見圖3。

圖3 玉米漿粉濃度與鳥苷產量關系Fig.3The relationship between the concentration of corn starch and the yield of vernine

由圖3可知，玉米漿粉濃度為0.2%時，鳥苷產量最高，產量達到6.2g/L。顯著性分析表明：玉米漿粉濃度為0.2% 時，鳥苷產量與0.1%，0.15%，0.25%，0.3%4組之間均存在極顯著性差異（P＜0.01），鳥苷產量呈現先上升后下降趨勢；玉米漿粉濃度達1.6%之后，隨著濃度增加，反而不利于鳥苷產量積累。

3.1.4 谷氨酸鈉濃度對鳥苷產量的影響

發酵條件同3.1.1，葡萄糖濃度為12%，酵母粉濃度為1.6%，玉米漿粉濃度為0.2%，選取谷氨酸鈉濃度0.8%，1.0%，1.2%，1.4%，1.6%5個水平，谷氨酸鈉濃度與鳥苷產量關系見圖4。

圖4 谷氨酸鈉與鳥苷產量關系Fig.4The relationship between the concentration of sodium glutamate and the yield of vernine

由圖4可知，當谷氨酸鈉濃度為1%時，鳥苷產量達到7.3g/L。顯著性分析表明：谷氨酸鈉濃度為1%時鳥苷產量與0.8%，1.2%，1.4%，1.6%4組之間均存在極顯著性差異（P＜0.01），谷氨酸鈉濃度對鳥苷發酵有顯著影響。

3.1.5 硫酸銨濃度對鳥苷產量的影響

發酵條件同3.1.1，葡萄糖濃度為12%，酵母粉濃度為1.6%，玉米漿粉濃度為0.2%，谷氨酸鈉濃度為1.0%，選取硫酸銨濃度為1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%5個水平，硫酸銨濃度與鳥苷產量關系見圖5。

圖5 硫酸銨濃度與鳥苷產量關系Fig.5The relationship between the concentration of ammonium sulfate and the yield of vernine

由圖5可知，當硫酸銨濃度為2.0%時，鳥苷產量達到6.2g/L，隨著硫酸銨濃度增加，鳥苷產量呈現先升高后下降的趨勢。顯著性分析表明：硫酸銨濃度為2.0% 時鳥苷產量與1.0%，1.5%，3.0%3組之間均存在極顯著性差異（P＜0.01），與2.5%組之間存在顯著性差異（P＜0.05）。

3.2 不同發酵條件對鳥苷產量的影響

3.2.1 接種時間對鳥苷產量的影響

鳥苷產量不僅與發酵培養基配方有關，還與種子生理性狀有很大關系。菌種培養時間不足，轉入發酵培養基中，會出現種子前期生長緩慢，整個發酵周期延長，產物開始形成的時間推遲等常見的幾種現象，甚至會出現發酵異常現象。菌種培養時間過長，菌體會在種子培養基中過早自溶，會影響后期鳥苷積累。選取培養8，10，12，14，16h的種子菌種轉入發酵培養基，接種時間與鳥苷產量關系見圖6。

圖6 不同接種時間與鳥苷產量關系Fig.6The relationship between the inoculation time and the yield of vernine

由圖6可知，培養12h的種子液轉移至發酵培養基得到鳥苷產量最高，達6.9g/L。顯著性分析表明：接種時間為12h時鳥苷產量與8，10，14，16h4組不同接種時間之間均存在極顯著性差異（P＜0.01），確定最適接種時間為12h。

3.2.2 接種量對鳥苷產量的影響

培養基中營養成分有限，接種量多少對鳥苷積累有顯著影響。接種量少，培養基得不到充分利用；接種量過多，培養基營養有限，會對鳥苷積累產生抑制作用。

圖7 接種量與鳥苷產量關系Fig.7The relationship between the inoculum size and the yield of vernine

選取接種量為6%，8%，10%，12%，14%5個水平，隨著接種量增加，鳥苷產量呈現先升高后下降的趨勢。由圖7可知，當接種量為10%時，鳥苷產量達到6.4g/L。顯著性分析表明：接種量為10%時鳥苷產量與6%，8%，14%3組不同接種量之間均存在極顯著性差異（P＜0.01），與12%接種量之間存在顯著性差異（P＜0.05），確定最適接種時間為12h。

3.2.3 發酵時間對鳥苷產量的影響

選取發酵時間48，54，60，66，72，78h6個水平，發酵時間與鳥苷產量關系見圖8。

圖8 發酵時間與鳥苷產量關系Fig.8The relationship between the fermentation time and the yield of vernine

由圖8可知，當發酵時間為72h時，鳥苷產量達到7.9g/L。顯著性分析表明：發酵時間為72h時鳥苷產量與48，54，60，66，78h5組不同發酵時間之間均存在極顯著性差異（P＜0.01），發酵時間對鳥苷產量有顯著性影響。

3.2.4 發酵pH對鳥苷產量的影響

發酵培養基pH是微生物發酵的一項重要的發酵參數，是微生物在發酵液中代謝活動的綜合指標。pH通過影響微生物內酶活力，從而影響微生物生長和產物積累。

圖9 發酵pH與鳥苷產量關系Fig.9The relationship between the pH and the yield of vernine

選取pH 值為6.6，6.8，7.0，7.2，7.4 5個水平進行發酵，由圖9可知，當pH值為7.0時，鳥苷產量最高，達到6.8g/L。顯著性分析表明：發酵pH為7.0時鳥苷產量與6.6，7.4 2組之間均存在極顯著性差異（P＜0.01），與pH 為6.8組存在顯著性差異（P＜0.05），與pH 為7.2組不存在差異性（P＞0.05），pH 在7.0～7.2范圍內，鳥苷產量較高。

4.文章字數控制在1500字或3000字左右，末尾附上作者姓名、單位、聯系方式、自我介紹（100字內）。

3.2.5 發酵溫度對鳥苷產量的影響

溫度對微生物發酵有很大影響。溫度通過影響微生物各種酶反應速率，改變微生物代謝調控機制，從而影響發酵培養基的理化性質，最終影響發酵產物的積累。

圖10 發酵溫度與鳥苷產量關系Fig.10The relationship between the fermentation temperature and the yield of vernine

試驗選取32，34，36，38，40℃5個水平，由圖10可知，最佳發酵溫度為36℃，此溫度下，鳥苷產量最高，達到8.0g/L。顯著性分析表明：發酵溫度為36℃時鳥苷產量與32，34，38，40℃4組不同發酵溫度之間均存在極顯著性差異（P＜0.01），發酵溫度對鳥苷產量有顯著性影響。

3.3 正交試驗

正交試驗設計和分析方法是目前最常用的工藝優化試驗設計和分析方法。鳥苷酸發酵培養基成分復雜，交互作用錯綜復雜，發酵條件對鳥苷產量影響顯著，因此，鳥苷酸發酵培養基和發酵條件優化工作尤為重要。

3.3.1 正交試驗結果

表1 正交試驗設計表Table 1Orthogonal test design table

為研究因素間的交互作用，采用L27（311）正交試驗表，見表2。

表2 正交試驗結果Table 2The results of orthogonal test

3.3.2 正交試驗結果分析

直觀分析見表3。

表3 鳥苷產量均值響應表Table 3The mean response of the yield of vernine

由表3可知，以鳥苷產量為評價指標，可知發酵溫度對鳥苷產量影響最大，各因素對鳥苷產量的影響依次為發酵溫度（B）＞發酵時間（C）＞葡萄糖濃度（A）。以鳥苷產量為分析指標，選擇鳥苷產量高的組合，通過直觀分析可知最佳組合為A1B2C2。

方差分析結果見表4。

表4 鳥苷產量方差分析表Table 4Analysis of variance of the yield of vernine

由表4可知，發酵溫度與發酵時間對鳥苷產量影響達到了極顯著性差異（P＜0.05），葡萄糖濃度對鳥苷產量影響不顯著，交互作用對結果均不顯著。由此分析，結合直觀分析結果，以鳥苷產量為指標，最佳組合為A1B2C2，即葡萄糖濃度10%，發酵溫度36℃，發酵時間72h。再次在發酵條件下進行驗證性試驗，得到鳥苷產量達到10.6g/L。

4 結論

單因素試驗確定了發酵培養基配方中葡萄糖、酵母粉、玉米漿粉、谷氨酸鈉及硫酸銨的最佳濃度，確定了發酵工藝參數適宜范圍，通過正交試驗對鳥苷產量有顯著性影響的葡萄糖濃度、發酵時間、發酵溫度3個發酵工藝條件進行優化，確定最優組合為葡萄糖濃度10%，發酵溫度36℃，發酵時間72h。在此條件下進行鳥苷發酵試驗，鳥苷產量達到10.6g/L，產量較優化前提高了71%。