發酵法提純草石蠶中水蘇糖的工藝研究

周文斯，熊犍，謝瑾，崔春，王煒

（華南理工大學 食品科學與工程學院，廣州 510640）

水蘇糖（Stachyose）是棉籽糖家族的一員。由半乳糖－半乳糖－葡萄糖－果糖構成的四糖，是一種非還原糖，廣泛分布于植物界，在植物的各個部分存在，與蔗糖同為糖類的運轉和儲存形式。在植物的冷適應中起重要作用，對于人類是一種功能性低聚糖，具有抑制腸道有害菌群增殖、改善排便功能、防止便秘、保護肝臟、降血壓和血脂、增強機體免疫力等功能［1－3］，其潛在的應用價值及巨大的經濟效益不容忽視。在草石蠶的肉質塊莖中含有水蘇糖［4］。

提取高純度的水蘇糖是其應用的基礎，是研究的熱點。目前，主要為物理法：水提法和醇沉法［5，6］。得到的水蘇糖提取物中含有蔗糖、葡萄糖等非功能糖，其含量占總糖的30%左右；這些非功能糖不易分離。生物法如曲霉、乳酸菌和裂褶菌輔助提取，生物法與物理方法相比可以得到純度更高的水蘇糖［7－9］。

黑曲霉（Aspergillusniger），是重要的工業發酵菌種［10］。食品工業上用作發酵菌種，如用于食醋生產制曲、麩曲法白酒生產制曲、檸檬酸發酵等。本研究根據微生物優先利用單雙糖的特性［11，12］，利用黑曲霉對草石蠶提取物進行發酵；較大限度地除去單雙糖，保留水蘇糖，提高水蘇糖的純度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草石蠶根莖：購于甘肅鎮原縣，洗凈曬干含水量8.0%；黑曲霉：購自濟寧玉園生物科技有限公司。

水蘇糖、棉籽糖（濃度98.0%）：Sigma公司；乙腈（色 譜 純）：RCI Labscan Limited 公 司；超 純 水：Millipore制備；D001大孔強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂、D301大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂：安徽皖樹化工銷售有限公司；所有溶劑和樣品溶液均用0.45μm微孔濾膜過濾；葡糖糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、鹽酸、氫氧化鈉、活性炭（粉）：均為分析純。

1.2 儀器與設備

ME204E型萬分之一電子天平 Mettler Toledo公司；百分之一電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司；DHG－9070A型鼓風干燥箱 上海慧泰儀器制造有限公司；XW－80A型旋渦混合器 上海精科實業有限公司；數顯電子恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市宏華儀器廠；GL－21M型高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；THZ－82A型水浴恒溫振蕩器 金壇市華城開元實驗儀器廠；RE－201型旋轉蒸發儀 上海申生科技有限公司；LGJ－1型冷凍干燥機 上海醫用分析儀器廠；Waters 600高效液相色譜儀、示差折光檢測器 美國 Waters公司；Waters ZORBAX NH2色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；Milli－Q 超純水制備器 美國Millipore公司。

1.3 方法

空白樣的制備：參考葉春華等［13］的方法并稍作修改。具體為：稱取洗凈干燥的草石蠶，用水提取其中的水溶性多糖，料液比（g/mL）為1∶15；提取溫度為75℃，提取時間為75min。

1.3.1 帶渣發酵對水蘇糖濃度的影響

按以上方法進行得到空白樣后，A1為過濾去除草石蠶殘渣的提取濾液；A2為不進行過濾處理，接種量為提取液重量0.02%的黑曲霉，30.0℃恒溫靜置培養48.0h，過濾得到發酵液A1和A2。

1.3.2 蔗糖酶抑制劑對水蘇糖濃度的影響

按照1.3.1實驗中不進行過濾處理，接種量為提取液重量0.02%的黑曲霉，向提取物B1中添加提取液重量0.01%的乙二胺四乙酸二鈉（EDTA－2Na）；向提取物B2中添加提取液重量0.01%的抗壞血酸（Vc），向提取物B3中添加等質量的水作為空白對照，30.0℃恒溫靜置培養48.0h，過濾得到發酵液B1，B2和B3。

1.3.3 發酵培養方式對水蘇糖濃度的影響

按照1.3.1實驗中不進行過濾處理，接種量為提取液重量0.02%的黑曲霉，添加提取液重量0.01%的乙二胺四乙酸二鈉（EDTA－2Na），提取物C1于30.0℃恒溫靜置培養48.0h，提取物C2于30.0℃恒溫培養48.0，12.0h前為靜置培養，12.0h后為液體震蕩培養，轉速為140r/min，過濾得到發酵液C1和C2。

1.3.4 水蘇糖濃度的測定

1.3.4.1 標準液的制備

分別準確稱取葡糖糖、果糖、木糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖標準品5.0，15.0，25.0，50.0mg，用乙腈－水（30/70，V/V）溶解并定容至 5.0mL，配成 1.0～10.0mg/mL的系列單標儲備液；分別準確稱取蔗糖、棉籽糖5.0，25.0，50.0，75.0，100.0mg，用乙腈－水（30/70，V/V）溶解并定容至 5.0mL，配成 1.0～20.0mg/mL的系列單標儲備液；準確稱取水蘇糖25.0，100.0，250.0，400.0mg，用乙腈－水（30/70，V/V）溶解并定容至5.0mL，配成5.0～80.0mg/mL的系列單標儲備液，置于冰箱0～4.0℃下保存。

1.3.4.2 混合標準溶液的制備

準確稱取上述1.3.4.1各糖類標準品50.0mg，用乙腈－水（30/70，V/V）溶解并定容至5.0mL，配成10.0mg/mL的混合標準液，置于冰箱0～4.0℃下保存。

1.3.4.3 樣品的制備

準確稱取冷凍干燥的水蘇糖0.50g，用乙腈－水（30/70，V/V）溶解并定容至5.0mL，經0.45μm 濾膜過濾，濾液供分析用。

1.3.4.4 色譜條件的選擇

高效液相色譜法是檢測低聚糖的主要方法之一［14］。參照王玉軍等［15］和潘城等［16］的方法并稍作修改。采用示差折光檢測器，選用色譜柱ZORBAX NH2柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為乙腈－水（70/30，V/V），柱溫為35.0℃，流速為1.0mL/min，進樣體積為10.0μL。

1.3.4.5 水蘇糖的標準曲線

按上述色譜條件測定峰面積，以水蘇糖濃度為橫坐標，峰面積值為縱坐標，由高效液相色譜直接得到水蘇糖標準曲線的回歸方程：y＝159063x＋9538.6，R2＝0.9997，繪制標準曲線，見圖1。

圖1 水蘇糖標準曲線Fig.1Standard curve of stachyose

1.3.4.6 標準品的色譜圖

采用上述分析條件，所得到的標準品色譜圖分離度均能達到要求，檢出的樣品色譜峰分離度好、峰形尖、對稱性好。標準品的保留時間分別為：木糖（5.769min）、果糖（6.517min）、葡萄糖（7.077min）、半乳糖（7.483min）、蔗糖（8.153min）、麥芽糖（9.422min）、乳糖（10.289min）、棉籽糖（12.281min）、水蘇糖（19.132min），標準品色譜圖見圖2。

圖2 標準品的色譜圖Fig.2Chromatogram of the standard sample

1.4 數據處理

用 OriginPro（Version 9.0）軟件對數據進行處理和圖表的繪制，數據代表平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 草石蠶提取液的成分分析

表1 草石蠶提取物的糖類組成Table 1Composition of saccharide in Stachys seiboibi extract%

本實驗利用的水提工藝，每100.00g草石蠶干可以熱提取出27.00g可溶性固形物，得率為27.00%。由表1可知，草石蠶提取物中的主要糖分為：水蘇糖52.69%，蔗糖 17.99%，棉籽糖 13.07%，葡萄糖8.18%及其他糖類8.07%。

2.2 帶渣對草石蠶提取物的影響

本文考察了空白樣是否分離除渣對提取率的影響，結果見圖3。

圖3 發酵糖分變化圖Fig.3Changes of carbohydrates during fermentation

由圖3可知，無論是否帶渣，水蘇糖的含量隨時間的增加而下降，在發酵12.0h時水蘇糖的含量最高；帶渣發酵的發酵液A2中水蘇糖的含量為14.06mg/mL，不帶渣的發酵液A1中水蘇糖的含量為4.29mg/mL。這是因為在空白樣品提取時，渣中還有殘余的水蘇糖沒有溶出，故在除去渣后，水蘇糖的含量增加不大，并開始降低；與文獻［17，18］報道的帶渣發酵的優勢相符。在帶渣的黑曲霉發酵體系中，糖類是黑曲霉的較好碳源，尤其是單糖（葡萄糖、果糖）和雙糖（蔗糖、麥芽糖、乳糖）等優先被利用，能夠有效地保留四糖水蘇糖并進一步提高其純度。然而，在發酵體系中超過12.0h后，水蘇糖的濃度開始下降。這是因為黑曲霉分泌出蔗糖酶，蔗糖酶在40～45℃酸性介質中具有較好的熱穩定性［19］，水解蔗糖的同時［20］，也將水蘇糖水解為甘露三糖和果糖。因此，本實驗選擇帶渣發酵對草石蠶中的水蘇糖進行純化。

2.3 蔗糖酶抑制劑對草石蠶提取物的影響

本文考察了乙二胺四乙酸二鈉和抗壞血酸作為蔗糖酶抑制劑對草石蠶提取物的影響，結果見圖4。

圖4 發酵糖分變化圖Fig.4Changes of carbohydrates during fermentation

蔗糖酶（EC 3.2.1.26，Sucrase），又稱轉化酶（invertase）或β－D－呋喃果糖苷酶（β－D－fructofuranosidase），能夠不可逆地催化蔗糖水解并產生葡萄糖和果糖［21］；還可以催化棉籽糖水解生成蜜二糖和果糖，水蘇糖水解生成甘露三糖和果糖，見圖5。

圖5 蔗糖酶催化蔗糖、棉籽糖和水蘇糖水解圖Fig.5The sucrase catalyzed hydrolysis of sucrose，raffinose and stachyose

部分化學試劑的存在會對酶的活性產生一定的影響。本實驗測定了EDTA－2Na和Vc兩種化學試劑對酶活性的影響。由圖4（a，b，c）可知，EDTA－2Na和Vc均能夠有效地阻止水蘇糖的降解，而且體系中的棉籽糖濃度下降，兩體系均大于空白的水體系。而添加了EDTA－2Na的發酵液B1中水蘇糖含量在0～24.0h不斷增加，在24.0h時水蘇糖的含量達到最大值。

在黑曲霉發酵體系中，反應前期（＜12.0h），以水蘇糖從渣中溶出為主；反應后期（＞12.0h），渣中的水蘇糖含量逐漸下降，溶液中的含量上升，蔗糖酶催化糖類水解的化學反應與黑曲霉吸收利用單雙糖的生化反應競爭共存。因此，添加適量的蔗糖酶抑制劑可以抑制蔗糖酶的活性，降低水蘇糖的水解，提高對水蘇糖的保留，從而達到純化水蘇糖的效果。

乙二 胺 四 乙 酸 二 鈉 （INS 386）和 抗 壞 血 酸（INS 300）均是常見的國際允許用于食品生產的食品添加劑。EDTA對蔗糖酶天然酶和修飾酶均有抑制作用［22］；EDTA對蔗糖酶的抑制作用大于抗壞血酸［23］。因此，在 酸 性 發 酵 體 系 中，本 實 驗 選 擇EDTA－2Na作為蔗糖酶抑制劑與黑曲霉混合發酵對草石蠶中的水蘇糖進行純化。

2.4 發酵培養方式對草石蠶提取物的影響

本文考察了靜置培養和靜置－液體震蕩兩階段培養方式對草石蠶提取物的影響，結果見圖6。

圖6 發酵糖分變化圖Fig.6Changes of carbohydrates during fermentation

由圖6（a，b）可知，與靜置培養C1相比，靜置－液體震蕩兩階段培養C2條件下，黑曲霉菌絲體生長較好，水蘇糖含量增加，而葡萄糖和蔗糖等單雙糖含量下降，水蘇糖純化效果較好。

黑曲霉是好氧性菌類，靜置培養和厭氧培養都不利于黑曲霉的生長。震蕩培養可以讓黑曲霉接觸更多的氧氣，有利于形成良好的發酵空間。丁蘭平等探究不同培養方式壇紫菜自由絲狀體生長及藻膽蛋白含量的影響，壇紫菜自由絲狀體在搖床培養條件下生長較好，特定生長速率可達10.83%～10.89%［24］。駱軍鑫等采用液體震蕩－靜置兩階段培養法進行靈芝液體深層發酵培養，與液體震蕩培養法相比，靈芝菌絲體胞內總三萜含量提高了1.7倍左右，總三萜產量提高了2.5倍左右［25］。因此，本實驗選擇采用靜置－液體震蕩兩階段培養法對草石蠶中的水蘇糖進行純化。

綜上所述，本文在上述單因素實驗的基礎上，得到黑曲霉發酵法提純草石蠶中水蘇糖的優化工藝為：準確稱取100.0g草石蠶干，提取溫度為75.0℃，時間為75.0min，料液比為1∶15提取后；接種提取液重量0.02%的黑曲霉，添加提取液重量0.01%的蔗糖酶抑制劑EDTA－2Na，采用靜置－液體震蕩兩階段培養方式進行發酵提取，發酵溫度為30.0℃，時間為24.0h。

2.5 優化工藝的驗證

通過20次平行實驗，黑曲霉發酵法提純草石蠶中水蘇糖的穩定性較高。發酵液通過高效液相色譜進行檢測，見圖7。

圖7 黑曲霉發酵液的高效液相色譜圖Fig.7HPLC of the broth of Aspergillus niger

20次實驗中草石蠶發酵液中單糖和蔗糖最終總量均小于總糖的3.00%，水蘇糖濃度可以從52.69%提高到80.43%，重復性良好。使用OriginPro（Version 9.0）軟件對水蘇糖含量和單雙糖含量進行相關性分析，相關系數r＝－0.746＊＊（表示相關性極顯著，P＜0.01）說明二者存在很強的負相關性，即相同發酵條件下，單雙糖含量越低，水蘇糖含量越高。

每100.0g草石蠶干，按照上述工藝提取后，活性炭脫色，離子交換樹脂進一步脫色和脫鹽，真空濃縮，冷凍干燥，制備得到產物32.06g水蘇糖（含量80.43%）。

3 結論

本實驗條件下，接種黑曲霉，添加蔗糖酶抑制劑EDTA－2Na，采用靜置－液體震蕩兩階段培養方式進行發酵提取，發酵溫度為30.0℃，時間為24.0h，可使糖液中單糖和蔗糖含量降至3.00%左右；水蘇糖濃度可從52.69%提高到80.43%。