白三葉對新疆秋季自然降溫的生理響應

李 倩，王玉祥，張 博

(新疆農業大學 草業與環境科學學院/西部干旱荒漠區草地資源與生態實驗室，新疆 烏魯木齊 830052)

白三葉(Trifoliumrepens)是我國大面積種植的富含蛋白質，營養豐富的優質牧草。白三葉草姿美、色翠綠、綠色期長，也是草坪草的骨干草種之一[1]。新疆野生白三葉是優良的牧草資源，具有抗病耐熱、抗寒、耐旱且耐鹽堿等特點[2]。白三葉不僅具有生長范圍廣、易于種植、便于管理等優點，而且有優越的固氮性能，使其對草地畜牧業的發展和維持草地生態系統的穩定都具有重要作用。

由于城鎮現代化的快速發展，大量的開發和開采土地，導致地表植被無表土層保護，直接暴露于光照下，使其蒸發加強，溫度變化劇烈。持續低溫會使植物發生凍害，嚴重時甚至死亡。低溫損傷是影響植物生產的主要原因之一，因此，探索植物抗寒性的生理機制在基礎理論和實際生產上具有重要現實意義。

新疆農業大學草業科學系經過10多年的栽培馴化，從新疆北疆地區20多個縣市的野生白三葉種質材料中選育出綜合性能較好的多個白三葉新種質。為了進一步探尋白三葉在自然降溫條件下生理生化指標的變化規律，試驗以選育的4個新種質A、B、C、D為材料，以海法(Trifoliumrepenscv.haifa，E)作為對照，在秋季自然降溫過程中取樣觀測葉片相對含水量、葉綠素、丙二醛、游離脯氨酸、可溶性糖的含量和膜質透性等指標的變化，探尋自然降溫對白三葉生長發育的影響，為進一步開展白三葉新種質的抗寒性研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗地設在新疆烏魯木齊市三坪農場草業試驗站，該站屬中溫帶大陸性半干旱氣候，光照資源豐富，月平均氣溫24.5℃，年降水量180 mm，年平均蒸發量1 780 mm，年均日照時數2 900 h，年均大于10℃的積溫3 500℃，無霜期為170～180 d。

1.2 試驗設計

以白三葉烏市南山(A)和(B)、昌吉(C)、呼圖壁(D)為供試材料，海法為對照(E)，海法為國外引進品種(表1)。2014年3月采用營養體移栽方式從呼圖壁草地生態站野生資源圃移栽到新疆農業大學三坪農場草業試驗站，每個種質3個小區，小區面積3 m×5 m，行距30 cm，株距10 cm，深度3 cm。

試驗于2015年8月17日開始取樣，9月26日結束，每隔10 d取樣1次，共取樣5次，取各植株展開的成熟葉片的中葉，3個小區進行混合取樣，重復3次，同時記錄取樣前3 d的平均溫度。取樣期間，田間溫度呈現逐漸降低的趨勢，取樣前3 d的平均溫度依次是28.0℃(T1，8月17日)、16.5℃(T2，8月27日)、13.0℃(T3，9月6日)、9.0℃(T4，9月16日)、6.5℃(T5，9月26日)。每次取完的樣品立即放入液氮中保存，用以生理指標的測定。

表1 參試材料信息

1.3 測量內容與方法

采用烘干法測量白三葉頂部葉片的相對含水量[3]、采用SPAD-502測定葉綠素含量、硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量[4]、蒽酮比色法測定可溶性糖[5]、磺基水楊酸-酸性茚三酮比色法測定游離脯氨酸含量[6]、電導率法測定膜質透性[3]。

1.4 數據處理

利用SPSS 19.0和Excel 2010軟件進行相關數據的處理和作圖。

2 結果與分析

2.1 降溫對葉片含水量的影響

自然降溫對白三葉葉片的相對含水量影響較大，隨著自然溫度的逐漸降低，5個品種的葉片含水量均呈現逐漸下降的趨勢。其中，當溫度從28.0℃逐漸降低到16.5℃時，5個白三葉的葉片含水量均有升高，在整個自然降溫過程中，D、E的葉片含水量在6.5℃時比9℃時高，種質B在16.5℃葉片含水量較高，達到83.41%。種質A在28.0℃下降到13.0℃過程中，葉片含水量變化不大(P<0.05),但溫度降到9℃和6.5℃時，與其他處理差異顯著(P<0.05)。白三葉葉片含水量在溫度16.5℃時高于其他(高溫和低溫)處理(表2)。

表2 自然降溫下白三葉葉片的含水量

注：不同字母表示同一種質各溫度變化差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 降溫對葉綠素含量的影響

自然降溫對5個白三葉的葉綠素含量均有影響，隨著溫度的降低，其變化趨勢一致。其中，A和B呈現逐漸降低的趨勢；C、D和對照E的變化晚于A、B 10 d，呈現逐漸降低的趨勢；種質不同葉綠素含量變化幅度不同。A，B，C和D的葉綠色含量在溫度從13.0℃降低到9.0℃的過程中變化幅度均較大，而E在此溫度下變化不明顯，但是E在8月17～8月27日，溫度從9.0℃降低到6.5℃時葉綠素含量突然下降，相比在16.5℃時候葉綠素含量下降29.30%，說明低于9.0℃可能使E失綠，相對其他種質來說，對照E對溫度的下降比較敏感。通過對試驗數據進一步分析表明，種質A，B和C在溫度從13.0℃下降到9.0℃時，葉綠素含量下降幅度最大，下降比例分別為13.10%，17.20%和19.01%，5個種質整個降溫過程葉綠素的變化幅度分別為26.36%、30.01%、27.36%、26.89%、29.26%。所有種質在溫度為16.5℃時，葉綠素含量最高(表3)，說明溫度在16.5℃時，有利于白三葉生長以及葉綠素的積累。種質A、B的葉綠素含量普遍高于其他種質。

2.3 降溫對丙二醛含量的影響

MDA是植物在逆境脅迫下產生的一種膜脂過氧化物，其含量的多少可以反應出膜脂過氧化物的大小，即受損害程度的大小[7-10]。低溫脅迫，破壞了細胞膜，使細胞通透性增加造成物質流失。隨著溫度的降低，各種質的丙二醛含量均呈現逐漸增加的趨勢，在5個溫度變化下，D、E種質的變化趨勢大于其他3個種質，2個種質在溫度從16.5℃降低到13.0℃時，丙二醛含量快速升高；種質E在溫度降低到6.5℃時又有一個快速變化點，說明種質E對溫度變化比較敏感。當溫度從28.0℃下降到6.5℃，各種質的變化幅度分別是56.81%、56.33%、56.86%、62.02%、65.24%。對照種質E的丙二醛含量相比種質A高2～3倍，說明對照組E的受傷害程度較大。A，B和C的MDA含量較低，變化幅度較小，說明葉片在溫度變化時，對溫度感應較敏感，生物膜受到的破壞在自身承受范圍內，損害程度較小(表4)。

表3 自然降溫下白三葉葉片的葉綠素含量

2.4 降溫對可溶性糖含量的影響

可溶性糖是植物的主要滲透調節劑，也是合成其他有機溶劑的碳架和能量來源，對細胞膜和原生質膠體起穩定作用。低溫脅迫通過影響增加細胞膜的通透性，使電解質外滲，營養物質流失，從而使可溶性糖含量相應增加。同一種質在自然降溫過程中，可溶性糖含量顯著上升，試驗在5個溫度處理下，各種質的變化幅度分別是61.71%、60.24%、50.02%、56.03%、58.01%，A、B的變化幅度較大，可溶性糖含量也相對其他種質較高，A的可溶性糖含量比對照E高出大約一倍(表5)。

表4 自然降溫對三葉葉片的丙二醛含量的影響

表5 自然降溫下白三葉葉片的可溶性糖含量

2.5 降溫對游離脯氨酸含量的影響

游離脯氨酸作為滲透調節物質，在逆境脅迫條件下,許多植物體內脯氨酸大量積累。積累的脯氨酸除了作為植物細胞質內滲透調節物質外,還在穩定生物大分子結構、降低細胞酸性、解除氨毒以及作為能量庫調節細胞氧化還原勢等方面起重要作用。試驗中，在自然降溫條件下，植物體內脯氨酸的含量顯著增加。脯氨酸對低溫的反應常隨著低溫程度的不同而異，在較低的長期低溫下，脯氨酸的增加是植物傷害的結果，而在無嚴重冷害的鍛煉溫度下，脯氨酸的積累則是一種適應性反應。5個種質隨著溫度降低，游離脯氨酸含量均逐漸增加。溫度從16.5℃下降到13.0℃時，游離脯氨酸變化幅度最大。在28.0℃和16.5℃時，A的游離脯氨酸含量相比對照組高了2倍；在13.0，9.0和6.5℃，A的游離脯氨酸含量高出對照組E約4倍。在5個溫度處理下，各種質的游離脯氨酸含量總體表現為A>B>C>D>E，變化幅度分別為83.87%、74.97%、78.04、75.75%、71.32%。在9月初自然降溫過程中，低溫脅迫進一步加大，葉片中的游離脯氨酸含量急劇增加(表6)。

表6 自然降溫下白三葉的游離脯氨酸含量

2.6 降溫對電導率的影響

細胞膜是活細胞與環境之間的界面與屏障，各種不良環境對植物的影響首先作用于細胞膜，改變其透性，細胞膜透性大小反映出細胞質膜受害程度。細胞膜結構和功能的紊亂和膜透性的變化是逆境脅迫作用的關鍵所在[11]。電導率越大，細胞膜透性越大，植物抗寒能力就越小[12]。

同一種質在不同溫度下的電導率呈現先減小后增加的趨勢,不同溫度下各個種質的變化幅度各不相同，5個不同溫度處理下，電導率變化幅度依次為30.06%、28.13%、29.57%、33.57%、39.52%。B的電導率變化最小，說明植物體內營養物質流失較少，細胞對溫度的脅迫的破壞抵御能力較好，使膜脂透性減小(表7)。

表7 自然降溫下白三葉的電導率

3 討論

在自然降溫過程中，白三葉各項生理指標發生顯著變化。5份白三葉種質的葉片相對含水量在逆境脅迫下呈現降低的趨勢，這與李亞萍等[13]的研究結果類似。研究表明，不同材料對生理指標的響應不同，呈現出不同的變化規律[14]，與研究不同品系的生理指標變化幅度也不同，抗寒性較強的品種下降趨勢較緩慢的結果相一致。低溫使葉片含水量降低[15]，減少細胞內外結冰，以增加其抗寒性[16]。由此說明，當溫度持續降低時，抗寒性種質的保水能力較強，水分損失較少。

增加可溶性糖含量可提高植物細胞的滲透調節能力，增加胞內溶質濃度，增強植物抗凍能力。秦文斌等[17]在甘藍中研究表明，低溫處理下，隨著處理時間的延長 4種甘藍的可溶性糖含量均有所增加,且耐寒品種的增加幅度較大[17]，與研究結果一致。對白三葉抗寒性的研究表明，當自然溫度降至8～2℃時，白三葉的可溶性糖含量出現不同程度的下降，隨著溫度的逐漸降低，白三葉可溶性糖含量出現升降交替的變化[18]。試驗只研究了自然降溫過程中28.0～6.5℃的5個梯度，并沒有研究0℃以下的可溶性糖含量，在持續低溫脅迫下，白三葉可溶性糖含量的變化規律有待進一步探究。

植物凍害與膜脂過氧化緊密相關，MDA是膜脂過氧化的最終產物，MDA與蛋白質結合后對質膜有毒害作用，MDA的含量一定程度上反映了耐寒性的強弱[19]。游離脯氨酸是植物耐寒性強弱的重要生理指標之一，也是植物細胞內重要的滲透調節物質，其含量的增加有利于細胞持水和生物大分子的穩定。在發生低溫、干旱、鹽漬等非生物脅迫時,大部分植物均會積累大量的脯氨酸[20],來保持細胞持水和生物大分子結構的穩定性,適應逆境。朱麗芳等[21]報道脯氨酸是植物逆境脅迫的產物，逆境環境會引起植物體內脯氨酸含量增加,這與此次研究結果一致。

研究結果發現在溫度降低至13.0℃時，丙二醛、可溶性糖、游離脯氨酸含量均顯著增加，其中，電導率的變化趨勢是先減少后增加，表明體內細胞受到較為嚴重的破壞，這與高婷婷[22]研究結果一致，隨著溫度的降低，其膜脂過氧化程度逐漸增加、細胞或組織大量脫水、細胞質膜透性增大[23]，電解質外滲，白三葉受溫度變化的危害程度逐漸增大[24]，但是未超過白三葉自身調節范圍。

4 結論

隨著自然溫度的降低，葉片含水量逐漸降低，種質A的葉片含水量變幅最大，下降幅度為11.23%；在16.5℃各種質的葉片含水量均達到最大值。葉片葉綠素含量變化呈降低趨勢，且種質C、D和對照E的葉綠素變化晚于A、B種質10 d；整個降溫過程中，丙二醛、可溶性糖和游離脯氨酸含量均呈現逐漸增加的趨勢，但對照E的丙二醛含量相比種質A高出2～3倍，D在6.5℃時丙二醛含量達到最大，為29.02 μmol/g；A的可溶性糖含量比對照E高出大約1倍，A的可溶性糖含量在6.5℃時最高，達到40.42 μg/g；A的游離脯氨酸含量比對照組高出2～4倍，A的游離脯氨酸在6.5℃最高，為189.23 μg/g，而E的游離脯氨酸在28℃時最小，僅有11.61 μg/g；電導率則呈現先減小后增加的趨勢，在16.5℃時5個白三葉種質的電導率均最低，A電導率在16.5℃時低至22.83%。綜合分析得出，在5個白三葉種質中，A、B對降溫的耐受性優于其他種質。