基因特異性分子標記在植物育種中的研究進展

張丹丹 周延清 楊珂

摘要：基因特異性分子標記是基于基因序列中功能性單核苷酸多態性（SNP）或插入和缺失（InDels）位點開發而成，具有選擇效率高、共顯性、與目標基因共分離、不受遺傳背景影響等優點，且與生物表型性狀高度相關，在生物表型性狀的鑒定中更突顯出其準確性和直接性，可以準確地跟蹤、定位不同遺傳背景下的目標等位基因，是農作物分子標記輔助選擇育種中理想的分子標記類型。對基因特異性分子標記的原理、開發及在植物育種的應用進行論述，并探討了基因特異性分子標記的發展趨勢，以期為分子標記輔助育種提供參考依據。

關鍵詞：SNP；InDel；PCR檢測；分子標記輔助育種；基因特異性分子標記

中圖分類號：Q341 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）11-0005-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.001

Abstract： Gene-specific molecular markers are directly developed from functional SNPs or InDels of the gene itself. It has several advantages such as high selective efficiency， co-dominant， co-separate with the target gene， unaffected by genetic background， high correlation to trait， accuration and directness， exactly track and location of target alleles gene under different genetic background， which is an ideal molecular marker for crop marker-assisted selection breeding. The present review concerned the advances on the principle， development， application and development trend of gene-specific molecular markers， which will provide reference to the molecular assisted breeding.

Key words： SNP；InDel；PCR detection；molecular marker-assisted breeding；gene-specific markers

分子標記（Molecular marker）是以生物大分子的多態性為基礎而發展起來的一種遺傳標記。可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質被稱為廣義的分子標記，而DNA分子標記被稱為狹義的分子標記[1]。DNA分子標記能夠直接反映DNA分子水平上的差異，具有穩定性、成本低廉和使用簡便等優點，已應用于基因組作圖、基因定位、遺傳多樣性評價、系統進化分析和法醫研究[2]、圖位克隆、功能基因組學研究、轉基因植物鑒定與分子標記輔助選擇育種等方面[3，4]。

基因特異性標記是基于目標基因內部DNA序列多態性開發的標記，與目標基因共分離，不受遺傳背景影響，與生物表型性狀高度相關，在生物表型性狀的鑒定中更突顯出其準確性和直接性，將成為生物分子標記輔助選擇育種中理想的分子標記類型[5]，已在水稻和小麥抗病基因[6-8]、油菜脂肪酸代謝基因[9，10]得到應用。隨著現代生物技術的發展，高通量測序技術逐步發展和完善，功能性分子標記提高生物品種改良效率的作用和優點越來越凸顯出來，其開發與應用必將越來越多。本研究從原理、開發及在植物育種的應用對基因特異性分子標記的研究進展進行概述，以期為該方面的研究提供參考。

1 基因特異性分子標記的原理和特點

基因特異性分子標記是從目標功能基因序列中功能性SNP（單核苷酸多態性）位點或InDels（堿基的插入-缺失）開發有效的功能標記。由于基因特異性分子標記是涉及表型性狀變異的功能基因內部多態性位點的開發，與隨機DNA分子標記相比，分子標記輔助育種具有以下優勢：①能準確跟蹤、定位功能等位基因，在作物表型性狀的鑒定中更具準確性；②高效率地篩選出育種所需的有利基因；③將影響相同或不同性狀的等位基因特異性分子標記組合，用于分子設計育種；④由于是直接來自基因位點上決定功能的多態性基序，一旦基因特異性分子標記被開發出來，可直接應用于人工育種群體和自然群體中。

2 基因特異性分子標記的開發

明確與作物表型性狀緊密相關的功能基因，并將其成功分離、克隆是基因特異性分子標記開發的首要條件。功能基因可以從公共數據庫、相關文獻或通過重測序獲得，將獲得的功能基因和等位基因進行序列比對，尋找功能基因內部的特定區域的SNP、InDel等多態性基序，開發出鑒定該功能基因特異SNP或InDel位點的分子標記。

2.1 基于SNP的基因特異性分子標記的開發

單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）主要是指由于單個核苷酸的變異而引起基因組水平上的DNA序列多態性，形式包括單堿基的缺失、插入、轉換及顛換等。SNP位點在基因內區域分布較多，有的功能SNP位點的改變，會引起基因堿基序列的改變，進而造成其所翻譯的蛋白質序列發生變化，對蛋白質的功能產生影響，從而引起生物性狀的改變，利用引起該變異的SNP位點設計功能基因特異性分子標記。然后，可以對試驗材料進行快速篩選，分析具有目標基因的材料，對分子標記輔助育種奠定基礎。如在作物抗性育種過程中，同一個抗性位點可能存在多個抗譜，多個不同的功能性等位基因，它們在序列上高度相似，對抗病等位基因進行序列比對，尋找各基因特異的SNP位點，設計特異性引物對該SNP位點特異性擴增，對抗性等位基因準確篩選，能提高植物抗性育種的精確性和效率。如水稻抗瘟病基因Pi9[11，12]、Pi35[13]、Piz-t[14]等，開發出了其特異性分子標記，對利用抗病基因培育水稻優良抗病品種提供重要依據。

SNP分子標記具有多態性豐富，在作物基因組中分布密度大、富有代表性、檢測速度快等特點[15]，但SNP的高檢測成本曾一度限制其在農作物育種中的使用，隨著高通量測序技術的發展，大量基因組序列的開發，為科研工作者提供了眾多物種的基因組序列信息，用基于PCR的方法對SNP進行檢測，使其變為簡單而高效的分子標記。

2.1.1 將SNP標記轉化為CAPS或dCAPS標記 酶切擴增多態性序列（Cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS）技術和衍生酶切擴增多態性（Derived cleaved amplified polymorphic sequence，dCAPS）技術是基于PCR擴增與酶切反應相結合的方法，即利用能夠區分識別目標SNP位點序列的某種限制性內切酶，對不同SNP區段的PCR片段進行酶切并電泳分型[16，17]。CAPS和dCAPs分子標記具有以下優點：①通常基于已知的基因；②僅需少量的DNA；③共顯性，僅用PCR和瓊脂糖凝膠電泳就能鑒定純合基因型和雜合基因型；其中最大的優勢是基于候選基因特征的基因型CAPS/dCAPS多態性，提高了育種程序中遺傳作圖和可靠分子標記應用的能力[18，19]。

通過對相關等位基因進行BLAST比對，獲得目的基因特異的SNP，若SNP位于限制性內切酶位點上，選擇合適的內切酶酶切PCR產物，通過對酶切片段分析建立與目標基因緊密連鎖的共顯性CAPS標記；若SNP所處的位置不是限制性內切酶識別位點，在該SNP位點的上游或下游設計引物時，引進錯配堿基以構成一個可以被限制性內切酶識別的位點，通過酶切片段的差異來獲得目的基因的特異性分子標記。王彩芬等[20]以水稻耐鹽基因SKC1基因的SNP突變體為材料，分析SNP突變位點前后的限制性酶切位點，建立了SKC1突變位點的CAPS標記，可用于耐鹽分子標記輔助選擇育種。華麗霞等[12]通過對抗稻瘟基因Pi9及其他在Pi2/9位點上鑒定到的抗性基因進行序列比對，在Pi9的第一內含子處存在一個特異SNP，在該SNP上游作為正向引物的3′末端引入一個錯配堿基G，將其轉化為dCAPS分子標記，所開發的Pi9特異性分子標記Pi9SNP可以將Pi9與定位于該位點上的其他抗性基因進行區分。

2.1.2 等位基因特異PCR（AS-PCR）策略 同CAPS和dCAPS標記一樣，用等位基因特異PCR（Allele-specific PCR，AS-PCR）檢測的SNP標記也是共顯性標記，不同之處在于AS-PCR使用的是自然錯配堿基，通過擴增不能產生PCR產物。通過對等位基因BLAST比對，來獲得目的基因的特異SNP位點，設計的特異性引物的3′末端和SNP位點對應的等位堿基完全匹配，需要在3′末端不同位置引入錯配堿基，若樣品中的SNP位點與特異性引物的3′末端相匹配，便能進行有效PCR擴增，反之則不能進行有效的PCR擴增，通過擴增條帶的有無來檢測目的基因。徐薪惟等[21]通過對I-2基因及其他等位基因進行序列比對，在I-2特異的SNP置于引物3′端，并在特異引物的3′端引入C-T堿基錯配的引物，退火溫度在58 ℃能根據擴增條帶的有無和片段大小，將I-2基因的突變位點和感病品種區分開，為番茄抗枯萎病輔助育種提供有力工具。等位基因特異PCR法（AS-PCR）通過巧妙設計特異引物，僅通過PCR反應就能將不同的SNP基因型分開，具有程序簡單、易于操作等優點，可用于分子標記輔助育種，但該方法由于特異性引物的穩定性較差，對擴增條件要求比較嚴格，操作繁瑣，只適合于小規模SNP的檢測。

2.1.3 PCR-CTPP方法 兩對交叉引物PCR（PCR with confronting two-pair primers，PCR-CTPP）方法是根據SNP位點不同的基因型設計2對不同的引物，經一次PCR擴增反應后進行瓊脂糖凝膠電泳，分析SNP等位基因的方法。PCR-CTPP方法的巧妙之處在于2對引物的設計，引物3′端堿基是引發延伸的起點，具有較高的穩定性，設計合理的錯配類型及在合適的位置引入人為錯配發生堿基錯配，在合適的PCR條件下，擴增效率較低，而正確的配對則可以使PCR擴增順利進行。通過設計的4條引物并利用待測品種基因組DNA進行PCR擴增，根據擴增條帶類型鑒定基因型。如抗稻瘟病基因Pi25[22]和Pi35[13]，通過改進的PCR-CTPP方法開發出了鑒定該功能基因的特異SNP位點的分子標記，利用該標記可快速鑒定水稻種質資源的基因型和進行分子標記輔助育種。PCR-CTPP方法具有快速簡單、成本低廉等優點，但是由于將2對引物放入同一個PCR體系中，可能存在復雜的相互作用，因此2對引物Tm值的設計、合理的錯配類型及錯配堿基的引入位置[23]都能提高PCR-CTPP的成功率。另外，改進的PCR-CTPP法如兩步法PCR-CTPP[24]、OPA-CTPP[25]的應用，使得PCR-CTPP技術有著更廣闊的應用前景。

2.2 基于InDel的基因特異性分子標記的開發

功能基因序列中堿基的插入、缺失會對基因的轉錄激活活性產生一定影響，從而影響植物的性狀[26]。InDel標記可通過片段長度差異直接檢測，是共顯性分子標記。基于InDel的基因特異性分子標記的開發是將等位基因BLAST比對后，查找篩選出特異的InDel位點，針對InDel位點來設計特異引物，進行PCR擴增，根據擴增產物片段的大小區分等位基因，從而獲得目的基因的InDel標記。聶京濤等[27]通過圖位克隆的方法獲得黃瓜白粉病抗性基因Mlo，并通過測序發現第11外顯子上的1 449 bp片段的插入/缺失，根據此插入/缺失突變設計InDel標記，對設計的3對特異性引物進行PCR擴增，產物差異較大，可以清晰區分抗、感親本，該InDel標記適合大多數黃瓜材料的白粉病抗性鑒定和分子標記輔助育種。

InDel標記本質上屬于長度多態性遺傳標記，可基于PCR擴增技術對InDel進行檢測。因此，用電泳平臺即可分型，相對于SNP標記操作更加簡單方便，電泳分型平臺有瓊脂糖凝膠電泳、變性或非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及毛細管電泳。InDel長度變化較大，應選擇多態性差異5～20 bp的InDel，這類InDel設計的成功率較高，并且便于檢測[28]。作為分布密度較廣的SNP和InDel標記，它們的分布不均勻，位置有一定互補性，可以根據目的基因的位置設計不同的分子標記[29]。明確功能基因的SNP和InDel位點，發掘出大量的功能基因，有利于進一步開發優良基因，并應用于分子標記輔助育種中。

3 基因特異性分子標記的應用

3.1 基因特異性分子標記在分子標記輔助育種中的應用

分子標記輔助育種利用與目標基因緊密連鎖的分子標記對個體進行優勢基因型的篩選，可在任何生長期進行，不受環境條件影響，可排除非等位基因相互作用造成的干擾，具有快速、經濟、效率高、準確性高等優點[30]。其中基因特異性分子標記是基于功能基因內部序列多態性開發的，與功能基因共分離，在分子標記輔助育種中更突顯出其準確性和直接性。Ramkumar等[6]根據抗稻瘟病基因Pi54的外顯子區域中的144 bp插入/缺失的多態性，創建InDel標記——Pi54MAS，可用于水稻分子標記輔助育種中。聶京濤等[27]開發了與黃瓜白粉病抗性主效基因/QTL共分離的3個共顯性InDel分子標記，可應用于分子標記輔助育種中；Jin等[31]將茶樹TCS1基因的1個SNP4318位點轉化成功能性標記dCAPS1，可用于分子標記輔助選擇中來提高茶質量。

3.2 基因特異性分子標記在功能基因鑒定、定位及遺傳圖譜構建中的應用

基因特異性分子標記可以將抗病等位基因進行鑒定和區分，用于抗病農作物品種的培育。利用基因特異性分子標記分布密度大和多態性高的特點，SNP或InDel位點與某些功能基因或QTL間的連鎖關系，可將功能基因精細定位和構建遺傳圖譜。華麗霞等[12]利用SNP-dCAPS標記，將抗稻瘟病基因pi2/pi9/piz-t與該位點上的其他抗性等位基因及感病等位基因分開，這為分子標記輔助育種及抗病基因聚合提供了有效的分子標記；蔡海亞等[14]檢測到水稻抗稻瘟病基因piz-t的特異性SNP位點，通過特異性引物對該SNP位點特異性擴增，實現piz-t等位基因的鑒定；張圣平等[32]獲得的黃瓜果實苦味（Bt）基因的InDel標記Bt-InDel-1，可用于無苦味黃瓜的分子標記輔助選擇育種及Bt基因的精細定位；張成才等[33]將8個茶樹品種中檢測到的39個SNPs轉化為CAPS標記，此標記可以用于茶樹遺傳多態性檢測和茶樹遺傳圖譜構建等方面的研究；Lv等[34]利用InDel標記，將結球甘藍抗枯萎病基因（FOC）定位于C06染色體上，為分子標記輔助選擇甘藍抗性育種奠定基礎。

3.3 基因特異性分子標記在種質資源分析中的應用

新品種的鑒定和篩選是作物育種中的重要環節，將不同種質資源進行分類，可以為種間的遺傳差異比較、雜交育種親本選擇等提供參考依據。馬建等[8]通過比對水稻抗、感品種中Pi35等位基因序列檢測出來的特異SNP，開發出Pi35基因的功能性分子標記pi35-dCAPS，對中國水稻核心種質資源和部分育成品種進行鑒定，以期發掘攜帶Pi35基因的新品質；Zhou等[35]選定的55個SNP標記和基因分型方法是咖啡種質資源管理的輔助工具。朱東旭等[36]篩選出286個結球甘藍相對于大白菜的特異InDel標記，并對實驗室獲得的大白菜-結球甘藍易位系進行初步鑒定，為大白菜-結球甘藍易位系的精確鑒定開辟了新途徑。郭廣君等[37]獲得的辣椒2號染色體35個多態性InDel標記可有效區分24份辣椒種質的多樣性和特異性，其聚類結果與表型特征吻合。基因特異性分子標記在種質資源的遺傳分析、品種區分上有很好的精確性，具有極大的應用價值。

4 展望

分子標記一直在不斷發展，不同分子標記各有其優缺點，根據研究目的，科學家可以選擇最合適的分子標記。各種分子標記的結合使用可節省標記的開發時間和成本，提高遺傳圖譜的精度和多態性，加快輔助育種的進度。如基于EST-SNP的CAPS標記的開發[38，39]；如基于RAPD、AFLP標記轉化的SCAR標記，提高了標記的穩定性，在輔助育種中更靈活、有效[40-43]。

RFLP、RAPD、AFLP及SSR等隨機DNA分子標記是基于基因組中隨機多態性位點開發而成，這些分子標記與目標基因的連鎖關系常常因基因重組而被破壞，從而影響標記的可靠性[44，45]。而基因特異性分子標記是基于植物表型性狀連鎖的目標功能基因序列中，特定區域位點上的 SNPs或 InDels開發的[5]，能準確地跟蹤、定位群體中的目標等位基因。基因特異性分子標記的開發首先要獲得與植物表型性狀密切相關的功能基因以及主效功能基因，而大量基因組序列未知，導致InDel和SNP的引物設計與開發存在一定的難度。隨著高通量測序技術的迅速發展，大量基因組序列的開發，可利用的國際公共數據庫序列信息的日益豐富，使得SNP和InDel標記的開發空間進一步提高。如SNP位點的開發方法有EST數據庫、擴增子重測序、全基因組序列、第二代測序技術等[46]；如分離、克隆功能基因的方法有圖位克隆[47]、比較基因組學[48]、電子克隆[49]等；如全基因組酶切位點的簡化測序技術RAD-seq技術[50]、TILLING和TS-PCR技術的結合[51]，使得SNP標記的開發及應用的效率大大提高；基因的功能鑒定通常能根據相似功能基因之間的序列同源性推測表達序列可能具有的功能；另外，表達譜分析等高通量的檢測方法、RNA干擾、定向誘變（TILLING）等也可以用來鑒定基因的功能[52]。如何使更多的功能基因被分離與鑒定，如何開發與功能基因緊密連鎖的分子標記，尤其是基因位點特異性標記，對于精準鑒定農作物抗性品種以及培育抗病品種具有重要意義。

隨著生物信息學、分子生物學、基因組學、基因芯片等的不斷發展與分子標記的相互融合，將出現更具體、更實用、更簡單的分子標記，分子標記在植物的研究方面將有更加廣闊的前景。

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