具有抗菌活性的水杉內生真菌的分離及篩選

張垚 白金峰 徐凱莉 劉寧

摘要：從水杉（Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng）樹皮、葉片中分離篩選得到了17株形態各不相同的內生真菌，采用對峙培養法篩選對植物病原真菌，層出鐮孢菌（Fusarium proliferatum）﹑禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）﹑玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）﹑玉米小斑病菌（Helminthosporium maydis）具有拮抗作用的菌株，篩選得到了1株對以上4種病原菌具有廣譜抗菌活性的菌株，命名為SS-17。通過對SS-17菌株的形態特征觀察及ITS分子鑒定，初步鑒定為黑附球菌（Epicoccum nigrum）。

關鍵詞：水杉（Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng）；內生真菌；篩選；抑菌活性；黑附球菌（Epicoccum nigrum）

中圖分類號：Q939.92 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）11-0036-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.008

Abstract： In this research，17 strains of the endophytic fungi were separated from the leaves and bark of Metasequoia glyptostroboides with different colony morphology，and the strains with antagonistic action were screened by dual culture method against plant pathogenic fungi including Fusarium proliferatum，F. graminearum，Setosphaeria turcica，Helminthosporium maydis. 1 strain was obtaind with antagonism to these strains above，named SS-17. With the morphology and ITS molecular identification of SS-17 strain，it was identified as Epicoccum nigrum.

Key words： Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng；endophytic fungus；screening；antibacterial activity；Epicoccum nigrum

水杉（Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng）是杉科水杉屬植物，是中國獨有的植物種類。它同時也是一種罕見的植物種類，被稱為“活化石”，它對古植物、古地理等的研究均有重要意義[1]。目前，人們對水杉的生態習性、病蟲害防治等方面已經進行了廣泛深入地研究[2-4]。近些年來，對水杉的生物活性的研究引起了人們的廣泛關注，2005年樊兵等[5]發現了水杉具有抗植物病毒的活性。吳光旭等[6]發現水杉莖葉提取物濃度是0.01 g/mL時，對霜疫霉孢子囊的萌發抑制率超過50%，并且對香蕉炭疽病菌也有一定的抑制作用。

植物內生真菌是指生存在植物組織內部或者生活史的某一階段存在于植物組織內部，并不會對植物組織致病的一類真菌[7，8]。目前，從已研究過的各類植物中都發現了內生真菌，對藥用植物中的植物內生真菌的研究較多，當前發現的內生真菌主要為子囊菌類及其無性型，包括腔菌綱、核菌綱等[9-11]。從植物內生真菌的次生代謝產物中分離得到的化合物具有抗菌、殺蟲、抗腫瘤等生物活性[12] 。Guo等[13]從櫟屬（Quercus）植物中分離得到了一株內生真菌Cytonaema sp.，其代謝產物可以抑制人巨細胞病毒蛋白酶的活性，從而達到抑制感染性人巨細胞病毒顆粒產生的作用。有些內生真菌還能夠產生細胞壁分解酶，用來克服宿主防御異物的天然屏障，還可以產生纖維素酶、果膠酶等[14]。研究還發現，植物內生真菌還能夠產生其他活性物質，如免疫抑制劑、降血糖活性物質等。

本試驗從水杉樹皮、葉片中分離篩選得到形態各不相同的內生真菌，采用對峙培養法篩選對植物病原真菌層出鐮孢菌（Fusarium proliferatum）﹑禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）﹑玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）﹑玉米小斑病菌（Helminthosporium maydis）具有拮抗作用的菌株，對其進行形態及分子生物學鑒定，為植物病害防治提供菌種來源。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

PDA培養基，LB培養基。

1.2 樣品采集

2014年5月28日在河北農業大學西校區進行采集水杉樹皮和葉片。采集部位和方法：用小刀刮取靠近水杉根部約20 cm的樹皮，再用小刀剪取水杉葉片。分別用無菌袋裝好后進行編號，用于內生真菌的分離或者存于4 ℃冰箱備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 內生真菌的分離與純化 將表面消毒處理后的樹皮及葉片接種于含150 μL氨芐青霉素（ampcilin）的PDA培養基上，25 ℃倒置培養，培養3～5 d后，選擇長勢較好的菌絲，挑取菌絲接于新鮮的PDA培養基中，25 ℃倒置培養，根據菌落形態特征挑取不同形態及位置的單菌落，于PDA培養基25 ℃倒置純化培養，獲得性狀穩定的內生真菌并編號，在4 ℃冰箱保藏。

1.3.2 內生真菌的分子生物學鑒定 用CTAB法提取形態各不相同的菌株的DNA，用ITS（ITS1、ITS4）通用引物進行PCR擴增，并送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.3.3 拮抗菌活性的測定 采用對峙培養法，在超凈工作臺中，將直徑為5 mm的供試病原真菌的菌塊接種于PDA培養基的內部，再將直徑為5 mm的植物內生真菌的菌塊接種于供試病原菌的左側。將只含有供試病原真菌的PDA培養基作為空白對照，25 ℃培養箱中倒置培養，培養3～5 d，測量供試病原菌菌落邊緣和植物內生真菌菌落邊緣之間的距離，選擇拮抗作用較明顯的菌株進行復篩和鑒定。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離純化

將水杉樹皮和葉片表面消毒后，分離植物內生真菌。經過分離單菌落、純化培養，3代以上得到性狀穩定的內生真菌，共分離得到17株形態各不相同的菌株。采用對峙培養法，在超凈工作臺中，將直徑為5 mm的供試病原真菌的菌塊接種于PDA培養基。

2.2 內生真菌對病原真菌的拮抗作用及抗菌譜

將從水杉樹皮及葉片中分離純化得到的17株內生真菌，通過對峙培養法，篩選對層出鐮刀菌﹑禾谷鐮孢菌﹑玉米大斑病菌﹑玉米小斑病菌4種供試病原真菌具有拮抗作用的菌株，結果見圖1。由圖1可知，菌株SS-17對以上4種病原菌均具有較強的拮抗作用。

2.3 SS-17菌株的鑒定

SS-17菌株在PDA培養基上，25 ℃倒置培養下，前期長出棉絮狀白色菌絲，菌絲由中心向邊沿擴展生長，呈“V”形，培養5 d后菌絲長滿皿，開始分泌黃褐色分泌物，菌落背面黃褐色，中心呈黑色，菌落的邊緣不整齊，如圖2所示。

在光學顯微鏡下觀察SS-17菌株的孢子和菌絲的形態特征，結果如圖3所示，SS-17菌絲多為無色或呈極淡褐色，分枝少、光滑，菌絲內有隔膜，分生孢子梗短小且粗，分生孢子從分生孢子梗頂端膨大的地方生出，分生孢子的顏色初期較淺，后期顏色加深為黑褐色。綜合形態特征及序列比較，初步鑒定該菌株為半知菌綱殼霉目杯霉科黑附球菌（Epicoccum nigrum）。

用CTAB法提取SS-17菌株的DNA作為模板，用通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增，擴增產物回收進行測序。使用MEGA5.1軟件，按鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統發育樹，如圖4所示。結果顯示，在水杉中分離得到的SS-17菌株與黑附球菌聚于相同進化支。綜合形態特征及ITS序列比對結果，鑒定該菌株為黑附球菌（E. nigrum）。

3 討論

黑附球菌屬半知菌亞門附球菌屬，廣泛地存在于土壤、空氣及剛死亡或幼嫩的植物組織表面，還可以作為寄生菌寄生在某些植物病原菌上，如小麥（Cochliobolus sativus）。黑附球菌大多數沒有致病性，但對沙棘果[15]、小麥[16]有一定的致病力，Hensel[17]和Ohtsubo[18]等認為，它可能是一種過敏原，其培養液提取物對小鼠有一定毒性。本試驗從水杉樹皮中分離篩選得到17株內生真菌，通過抑菌試驗篩選出SS-17菌株有較強的拮抗作用，利用形態觀察和ITS分子鑒定，發現該菌株ITS序列與附黑球菌同源性高，初步鑒定該菌株為黑附球菌。

黑附球菌可以在衰老的或剛死亡的植物組織表面快速地產生分生孢子，并能夠產生可以抗真菌的化合物，因此，它是一種防治農作物病害較為理想的生防菌[19]。Liu等[20]試驗結果顯示，黑附球菌的發酵液經去除多糖后的余液可以抑制病疫霉孢子囊釋放游動孢子。已有研究表明，黑附球菌產生的酶類物質的主要作用為降低這些菌類細胞膜的通透性，或者干擾周圍其他菌類及降解其細胞壁的化學成分。

隨著生物技術迅速的發展，基因工程技術等相關手段被用于篩選耐化學藥劑、具有高產率的黑附球菌，從而為其開發和利用提供良好的材料。目前，發酵體系是黑附球菌的利用基礎，因此摸索并建立適合黑附球菌的不同菌株的發酵體系，具有很重要的理論和現實意義。關于生防菌附球菌和病原菌之間的互作機制還不是很清楚，這對于黑附球菌的生物防治作用的提高極其重要，需要進一步深入研究；對其次生代謝產物的分離和提取，也是將來研究的主要方向。

4 結論

本試驗從水杉葉片及樹皮中分離篩選得到17株菌落形態不同的內生真菌；通過對峙培養，篩選得到的SS-17菌株對層出鐮刀菌﹑禾谷鐮刀菌﹑玉米大斑病菌﹑玉米小斑病菌具有較強的拮抗作用；通過對SS-17菌株的形態特征觀察及ITS分子鑒定，鑒定該菌株為黑附球菌。

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