乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑對小鼠的急性毒性研究

張振東 楊亞軍 劉希望 孔曉軍 馬寧 申棟帥 李劍勇

摘要：為了對乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑的安全性進行評價，采用簡化寇氏法進行了小鼠的急性毒性研究。首先通過預試驗的最小致死劑量（LD100）和最大耐受劑量（LD0）確定給藥劑量及試驗分組。皮下注射給藥，觀察7 d，記錄死亡數，計算LD50及95%的置信區間。結果表明，乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑對小鼠的急性毒性LD50為5.903 g/kg，95%置信區間為5.105 3～6.415 0 g/kg。按照化學藥物劑量分級，乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑可認定為實際無毒物質，說明該藥臨床皮下注射使用安全。

關鍵詞：乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑；LD50；小鼠；急性毒性

中圖分類號：S859.83 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）11-0068-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.016

Abstract： An acute toxicity test of Eprinomectin in situ gel injection on mice was taken to evaluate its safety by simplified Karber's method. The dosage and grouping were determined based on the minimum lethal dose（LD100） and the maximum tolerated dose（LD0） in preliminary experiment. The mice were administered with Eprinomectin in situ gel injection and observed seven days. The number of deaths was recorded for calculating the LD50（lethal dose 50%） and the 95% confidence limit. The results showed that the acute toxicity LD50 of Eprinomectin in situ gel injection on mice was 5.903 g/kg，95% confidence limit ranges was from 5.105 3～6.415 0 g/kg. It indicated that the Eprinomectin in situ gel injection was non-toxic substances according to chemically drug classification.

Key words： Eprinomectin in situ gel injection；LD50；mice；acute toxicity

乙酰氨基阿維菌素（Eprinomectin，EPR）是由Merk公司1997年開發出的大環內酯類體內外殺蟲劑，是一種高效、廣譜、低殘留的獸用新一代抗寄生蟲藥物[1]。EPR在防治畜類（特別是產乳期）的虱、螨、蠅等各種內外寄生蟲時效果很好并且休藥期很短，在治療奶牛寄生蟲病時休藥期僅為1 d[2，3]。它也通過了美國FDA批準可在動物孕期和哺乳期安全使用，由于它在牛奶中的分布系數極低，目前在國外已被廣泛用于乳制品的生產行業。EPR是目前世界上使用較多的動物抗寄生蟲用藥物[4，5]。EPR殺滅寄生蟲的作用機理與其他阿維菌素類藥物非常相似。EPR屬于γ-氨基丁酸（GABA）激動劑，當它達到一定濃度時可以和動物體內的神經細胞、神經傳導器等有效結合，這樣就會阻斷氯離子通道，進而阻斷動物的神經末梢或者神經肌細胞相互間的傳遞，從而使動物體內的寄生蟲麻痹，繼而殺死寄生蟲[6]。為此，以小鼠為試驗動物進行乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑的急性毒性試驗，旨在為指導臨床科學、安全地使用該注射劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗動物：SPF級昆明系小鼠110只，購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所，體重18～22 g，雌雄各半，雌性未產未孕。雌雄分籠飼喂，自由采食飼料、飲水。試驗前臨床健康觀察7 d，以適應試驗環境。

供試藥品：乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑，中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所農業部獸用藥物創制重點實驗室制備，批號：171016。試驗前，精密稱定處方中主藥及輔料，配制成0.05 g/mL的原位凝膠注射劑，待用。按照處方中各輔料的用料配比，配制輔料對照組（不含主藥乙酰氨基阿維菌素）。

1.2 試驗方法

1.2.1 預試驗 采用遞加法分別進行乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑組預試驗以及輔料對照組預試驗。

乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑預試驗：將20只昆明系小鼠平均分為5組，每組4只，雌雄各半，分別給小鼠稱重，計算給藥劑量。最高劑量組為10.0 g/kg，最低劑量組為1.0 g/kg。皮下注射，觀察7 d，記錄小鼠的死亡數，得到最小致死劑量（LD100）（記為b）和最大耐受劑量（LD0）（記為a）。確定組數N以及各組間劑量比r。

N由預試驗的最小致死劑量（LD100）b與最大耐受劑量（LD0）a的比值來確定。

r=lg-1[（lgb-lga）/（N-1）]

輔料對照組預試驗方法同上。

1.2.2 正式試驗 由預試驗結果可知，輔料預試驗的LD100大于5.0 g/kg，將小鼠樣本量增至10只，雌雄各半，仍未出現死亡現象，按照化學藥物毒性分級屬于實際無毒，因此得到結論，該注射劑輔料實際無毒。根據乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑預試驗得到的最小致死劑量（LD100）和最大耐受劑量（LD0），采用簡化寇氏法[7]計算正式試驗組數N以及各組間劑量比r。

根據乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑預試驗結果將正式試驗分為6組，其中包括空白對照組1組以及不同劑量給藥組5組。將60只昆明系小鼠隨機分為6組，每組雌雄各半。試驗組的給藥劑量分別為10.000、6.750、4.500、3.000、2.000 g/kg，空白對照組給予等量的飲用水。皮下注射給藥，觀察7 d，自由飲水，采食，觀察小鼠的外觀體征、飲食欲、行為活動、大小便等相關癥狀。給藥后4 h，持續觀察；4～8 h內每30 min觀察一次；8～12 h，每1 h觀察一次；12～48 h，每3 h觀察一次；3 d后每天觀察3次，直至第7天結束。記錄每組小鼠死亡只數，對死亡動物進行剖檢，與空白組對照，觀察各組織器官的病理變化。用簡化寇氏法計算LD50及95%的置信區間。

2 結果與分析

2.1 預試驗結果

輔料預試驗組的LD100大于5.0 g/kg，增加試驗動物數量至10只，仍未出現死亡現象，按照化學藥物的毒性分級可以視為實際無毒。

乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑試驗組預試驗的LD100為10.0 g/kg，LD0為2.0 g/kg。從而確定正式試驗的組數N為5。各組之間的劑量比值r=1.5。由此將正式試驗分為6組，其中5組為不同劑量給藥組，1組為空白對照組。

2.2 正式試驗結果

觀察給藥后動物表現出的癥狀為：小鼠被毛逆亂、精神沉郁，全身顫栗，眼睛微閉，食欲不振，對外界刺激反應遲鈍，個別小鼠出現四肢無力等現象，死亡前出現全身震顫、側翻現象，持續10～30 min死亡。高劑量組的癥狀明顯，低劑量組癥狀較輕微。小鼠死亡時間集中在1～3 h，1 d后再無死亡現象，癥狀逐漸緩解。

對死亡動物剖檢，與空白對照組相比，死亡動物的口唇、四肢、尾巴青紫。高劑量組中，肝臟腫大，顏色為深褐色，有針尖狀散在出血點分布于肝臟邊緣，且高劑量組癥狀明顯。

正式試驗小鼠死亡情況見表1。根據簡化寇氏法計算LD50以及95%置信限，公式如下：

式中，Xm為最大劑量的對數；i為組距，即相鄰兩組劑量對數值之差；p為各劑量組死亡率，q為各劑量組存活率；∑p為各劑量組死亡率之和；n為各組動物數；sx50為lgLD50的標準誤差。

計算得到LD50為5.903 g/kg，95%置信區間為5.105 3～6.415 0 g/kg。根據化學物急性毒性（LD50）劑量分級可知，乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑為實際無毒物質。

3 小結

試驗嚴格遵守《獸藥研究技術指導原則匯編》[8]中對藥物急性毒性試驗的相關規定。試驗選用SPF級昆明系小鼠為試驗動物，保證試驗動物本身清潔無污染，有效消除試驗誤差。在給藥過程中，嚴格按照皮下注射給藥[9]中的操作，以防由于操作方法不當而導致小鼠死亡，影響試驗結果的準確性。由試驗結果可知，小鼠給予乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑后，出現精神倦怠、食欲減退、生長遲緩等現象，根據小鼠的死亡數計算乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑的半數致死劑量（LD50）為5.903 g/kg，95%置信區間為5.105 3～6.415 0 g/kg。由化學物毒性分級可知，乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑為實際無毒物質。乙酰氨基阿維菌素作為一種高效、廣譜、低殘留的獸用新一代抗寄生蟲藥物[10]，本研究對其新制劑乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑的安全性進行了評價，以期為該制劑的后續研究及臨床推廣應用奠定基礎。

參考文獻：

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