分子生物學(xué)方法在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

楊碧曉

【摘 要】隨著食品安全問(wèn)題日益突出，傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法耗時(shí)長(zhǎng)，檢出率低，所以及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)出食品中病原微生物是其安全檢測(cè)的重要內(nèi)容， 隨著分子生物學(xué)快速發(fā)展，其特異性和靈敏性備受矚目。我們主要介紹基因探針檢測(cè)法、PCR檢測(cè)法和基因芯片檢測(cè)法的原理、開發(fā)及其在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用。雖然這些方法具有快速、高效的優(yōu)勢(shì)，但存在檢測(cè)成本高，假陽(yáng)性等問(wèn)題，因此開發(fā)靈敏，快速簡(jiǎn)易的食品病原微生物檢測(cè)方法，對(duì)食品安全檢測(cè)技術(shù)發(fā)展將有很大推動(dòng)作用。

【關(guān)鍵詞】分子生物學(xué)方法；食品微生物檢測(cè)

一、前言

隨著食品安全問(wèn)題的日益突出，國(guó)家對(duì)其愈發(fā)重視，它關(guān)系到人們生命健康，傳統(tǒng)細(xì)菌檢驗(yàn)方法雖靈敏度高，費(fèi)用低，但步驟繁多，通常需要幾天時(shí)間才獲得結(jié)果，有時(shí)難以檢測(cè)生長(zhǎng)緩慢、營(yíng)養(yǎng)苛求菌以及新的病原微生物。此外培養(yǎng)基制備、細(xì)菌培養(yǎng)、菌落計(jì)數(shù)和生化指標(biāo)的檢測(cè)都增加了實(shí)驗(yàn)室工作量。無(wú)論是食品加工業(yè)還是相關(guān)檢測(cè)部門都迫切需要快速的食源性致病菌檢測(cè)方法。傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)已不能滿足食品安全問(wèn)題，對(duì)DNA的直接檢測(cè)可以使結(jié)果更準(zhǔn)確、科學(xué)。

二、分子生物學(xué)概述與在食品微生物檢測(cè)中應(yīng)用的必要性

（一）概述

1.分子生物學(xué)概念

分子生物學(xué)是從分子水平上來(lái)研究生命現(xiàn)象的一種物質(zhì)性基礎(chǔ)學(xué)科，是通過(guò)研究細(xì)胞成分的物理、化學(xué)性質(zhì)以及這些變化所引發(fā)的生命現(xiàn)象。在工作過(guò)程中，是通過(guò)研究生命發(fā)展過(guò)程來(lái)表達(dá)出生命現(xiàn)象本質(zhì)的一種現(xiàn)代化學(xué)科。

2.分子生物學(xué)的應(yīng)用意義

在分析當(dāng)前社會(huì)發(fā)展實(shí)踐時(shí)，分子生物學(xué)的應(yīng)用已有效解決了當(dāng)今社會(huì)發(fā)展面臨的許多全球性問(wèn)題。通過(guò)了解酶催化的原理和反應(yīng)，已經(jīng)設(shè)計(jì)出各種新型催化劑用于化學(xué)工業(yè)，也為其發(fā)展帶來(lái)新的變化和革命。同時(shí)，在今天的食品安全工作中，其應(yīng)用對(duì)優(yōu)化食品微生物檢測(cè)技術(shù)，提高食品安全性，為食品加工業(yè)和人類生命安全發(fā)展提供高質(zhì)量保證具有重要意義。

（二）意義

食品安全標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定食品不能添加對(duì)人體健康有害的物質(zhì)。食品安全性與社會(huì)和人類健康的穩(wěn)定發(fā)展有關(guān)，它是一個(gè)全球性問(wèn)題。人體健康主要?dú)w功于食物。近年來(lái)，中國(guó)發(fā)生了一系列食品安全事件，造成消費(fèi)者恐慌，食品安全問(wèn)題日益受到重視。微生物污染作為嚴(yán)重的食物污染問(wèn)題可能會(huì)導(dǎo)致食物變質(zhì)和食物中毒。因此，為了避免，應(yīng)采用科學(xué)合理高效的方法檢測(cè)，確保食品安全。在當(dāng)前社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中，傳統(tǒng)的病原微生物檢測(cè)方法由于步驟繁多，工作效率低，無(wú)法滿足食品安全要求。因此，檢測(cè)工作逐漸選擇采用更加精確的技術(shù)手段進(jìn)行控制，并選擇科學(xué)的測(cè)試方法。分子生物學(xué)在這個(gè)社會(huì)背景下引起人們關(guān)注，并逐漸在各領(lǐng)域得到應(yīng)用。其方法與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比具有較好的優(yōu)勢(shì)，大大提高了食品微生物檢測(cè)水平，更及時(shí)發(fā)現(xiàn)食品中存在的安全問(wèn)題，有效保障人民群眾生命健康。

三、分子生物學(xué)在食品微生物檢測(cè)中的技術(shù)

（一）核酸分子雜交方法

這種方法也被稱為基因探針技術(shù)，為DNA分析奠定了良好的基礎(chǔ)，并在相關(guān)領(lǐng)域得到了認(rèn)可。核酸分子雜交方法利用堿基配對(duì)原則來(lái)退火適當(dāng)數(shù)量的核酸單鏈以形成雙鏈。因?yàn)槿魏尾≡w都具有特定的核酸片段，通過(guò)分離和標(biāo)記這些核酸片段制成的探針與待測(cè)樣品進(jìn)行雜交。如果樣本中存在特定病原體，則探針和核酸序列結(jié)合。標(biāo)記物通過(guò)特殊的方法來(lái)確定病原體的特異性。核酸分子雜交方法可以準(zhǔn)確檢測(cè)病原微生物，而不會(huì)干擾非致病微生物。該方法靈活并且具有非常廣泛的應(yīng)用。在我國(guó)目前的社會(huì)發(fā)展中，受到食品安全管理部門的青睞，在中國(guó)食品工業(yè)的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

在目前的食品微生物檢驗(yàn)工作中，可以說(shuō)這是一種應(yīng)用非常廣泛的技術(shù)，它可以應(yīng)用于檢測(cè)特定的RNA和基因序列，是一種非常有效的工具。該技術(shù)對(duì)于檢查特定致病微生物具有重要意義。以美國(guó)為例，該技術(shù)在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用已有很長(zhǎng)一段時(shí)間，但其優(yōu)勢(shì)仍存在一些不足之處。例如，它含有大量的放射性。同位素會(huì)對(duì)人體造成很大的不利影響，處理反應(yīng)廢物也很困難，需要非常復(fù)雜的步驟，反應(yīng)產(chǎn)生的廢物更難處理。

（二）PCR技術(shù)

PCR技術(shù)通過(guò)變性和復(fù)性的原理在體外使用DNA聚合酶，通過(guò)引物和脫氧核糖核苷酸在數(shù)小時(shí)內(nèi)的作用擴(kuò)增模板。該技術(shù)可以選擇性擴(kuò)增DNA序列。因此，PCR技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域有著極其廣泛的應(yīng)用。它在食源性致病微生物的檢測(cè)中也起著重要作用。一般食品微生物檢測(cè)主要分為四個(gè)環(huán)節(jié)，即增菌，分離培養(yǎng)，生化實(shí)驗(yàn)和血清學(xué)鑒定。通常需要4天才能產(chǎn)生結(jié)果。傳統(tǒng)方法缺乏靈敏度和特異性，測(cè)試結(jié)果不能有效指導(dǎo)生產(chǎn)。隨著PCR技術(shù)的出現(xiàn)，食品衛(wèi)生檢驗(yàn)迎來(lái)了良好的發(fā)展前景，能夠快速，準(zhǔn)確地檢測(cè)食品中的病原微生物。目前，分子生物學(xué)技術(shù)也在不斷完善，各種PCR方法已應(yīng)用于食品病原微生物的檢測(cè)，縮短了檢測(cè)周期，提高了檢測(cè)的靈敏度。在常規(guī)PCR技術(shù)檢測(cè)中，由于PCR循環(huán)次數(shù)，酶質(zhì)量和模板制備的影響，PCR技術(shù)可能在檢測(cè)時(shí)受到許多因素的影響，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的偏差。因此，我們必須在檢測(cè)過(guò)程中處理相關(guān)影響因素以防止出現(xiàn)錯(cuò)誤。

（三）基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是利用顯微印刷等技術(shù)手段，將核酸探針固定在載體表面，與標(biāo)記樣本雜交檢測(cè)雜交信號(hào)，從而提高檢測(cè)速度和準(zhǔn)確性。基因芯片技術(shù)使用基于樣本中芯片探針和靶基因片段的特定核酸雜交。具體步驟如下。首先，將多種基因寡核苷酸置于芯片的表面上以處理微生物，然后提取和擴(kuò)增核酸，并使用熒光素制備各種標(biāo)記以使它們?cè)谛酒闲纬晒押塑账帷ｋs交酸性位點(diǎn)，使用掃描儀檢測(cè)樣品中特定微生物的存在或不存在并分析熒光分布模式。核酸雜交與基因芯片原理基本一致，但基因芯片也需要根據(jù)檢測(cè)需要設(shè)計(jì)探針固化，只需要一次雜交即可檢測(cè)多個(gè)靶基因信息，快速，準(zhǔn)確，準(zhǔn)確度和靈敏度高，是鑒別有害微生物的重要手段。

（四）質(zhì)粒DNA圖譜分型技術(shù)

質(zhì)粒DNA分析技術(shù)首先在應(yīng)用過(guò)程中用作分析分型管理和控制技術(shù)，通過(guò)事先提取質(zhì)粒DNA并在測(cè)試前通過(guò)瓊脂糖凝膠測(cè)試病原微生物的流行病學(xué)。膠分離的DNA由于不同菌株所含質(zhì)粒DNA的序列號(hào)和大小不同，有必要事先通過(guò)質(zhì)粒圖預(yù)先分離不同的突變，以確保分型技術(shù)合理的應(yīng)用。通過(guò)質(zhì)粒的限制性核酸內(nèi)切酶消化可以增強(qiáng)質(zhì)粒譜重現(xiàn)性和分辨力。

四、結(jié)束語(yǔ)

隨著社會(huì)、國(guó)家對(duì)食品安全關(guān)注不斷提高，對(duì)食品病原菌檢測(cè)要求也越來(lái)越高。準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法是其檢測(cè)發(fā)展方向。檢測(cè)手段不斷進(jìn)步，分子生物學(xué)方法在食品微生物檢測(cè)中起到越來(lái)越重要的作用，通過(guò)DNA、基因芯片等技術(shù)可以有效檢測(cè)食品所含物質(zhì)。

雖然這些方法具有快速、高效的優(yōu)勢(shì)，但存在檢測(cè)成本高，假陽(yáng)性，操作困難，需檢測(cè)人員具有相當(dāng)?shù)姆肿由飳W(xué)背景知識(shí)等問(wèn)題，有些技術(shù)大多處于實(shí)驗(yàn)室階段，不能廣泛應(yīng)用，僅能作為輔助手段。因此開發(fā)靈敏、快速、簡(jiǎn)易的食品病原微生物檢測(cè)方法，對(duì)食品安全檢測(cè)技術(shù)發(fā)展將有很大推動(dòng)作用。

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