抗人PD-L1單克隆抗體的瞬轉(zhuǎn)表達(dá)

史晶瑩, 郭 晶, 李 雪, 董 雪, 孫 博, 吳叢梅, 殷玉和

(1. 長春工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 長春 130012； 2. 吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 長春 130012)

程序性死亡配體1(PD-L1)是一種相對分子量約為53 000的Ⅰ型跨膜蛋白[1]. PD-L1與其程序性死亡受體1(PD-1)結(jié)合, 其分子途徑是共信號通路的負(fù)調(diào)節(jié)劑[2-4], 作為細(xì)胞檢查點能抑制針對癌癥的炎癥和免疫應(yīng)答[5]. 在腫瘤的微環(huán)境中, 激活PD-1/PD-L1通路可導(dǎo)致免疫抑制并介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[6-8]. 目前, PD-L1抗體藥物研發(fā)已成為抗腫瘤藥物研究的熱點. PD-L1抗體的常用轉(zhuǎn)染方式分為瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn), 表達(dá)PD-L1抗體宿主細(xì)胞主要有HEK293和CHO等[9]. 在轉(zhuǎn)染方式上, 穩(wěn)轉(zhuǎn)比瞬轉(zhuǎn)產(chǎn)量高, 但其過程較長, 費用較高, 不適合高效小規(guī)模表達(dá)抗體蛋白[10]; 瞬時轉(zhuǎn)染重組DNA不與染色體上的DNA整合, 可在較短時間內(nèi)得到由重組DNA表達(dá)的產(chǎn)物, 且基因拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)染效率相對穩(wěn)定[11], 適用于抗體藥物前期的研發(fā). HEK293細(xì)胞與CHO細(xì)胞相比, 具有生長速率快并提高抗體表達(dá)量等優(yōu)點[12], HEK293 6E細(xì)胞是腺病毒核抗原轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞中, 二者基因發(fā)生整合, 其穩(wěn)定表達(dá)能增強(qiáng)巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子后的外源基因轉(zhuǎn)錄能力的腺病毒13SEla蛋白[13]. 通過基因整合的HEK293 6E細(xì)胞能更高效表達(dá)抗體蛋白. 由EBNA病毒改造的HEK293 6E與含有OriP元件的pTT5載體結(jié)合可導(dǎo)致核定位. 由于載體通過核孔進(jìn)入細(xì)胞核能加大外源基因與細(xì)胞基因組整合[14], 因此無血清懸浮培養(yǎng)的HEK293 6E細(xì)胞與對應(yīng)的pTT5載體更適于研究抗體表達(dá).

本文通過無血清培養(yǎng)HEK293 6E懸浮細(xì)胞, 篩選適合HEK293 6E細(xì)胞生長和表達(dá)的最佳培養(yǎng)基， 在此基礎(chǔ)上優(yōu)化瞬時轉(zhuǎn)染條件, 最終獲得高質(zhì)量濃度的PD-L1抗體, 成功建立了無血清懸浮培養(yǎng)HEK293 6E細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)表達(dá)PD-L1抗體體系.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒 HEK293 6E細(xì)胞與已構(gòu)建好的以pTT5為載體抗體輕重鏈質(zhì)粒, 由長春工業(yè)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實驗室保存.

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 FreeStyleTMF17無血清細(xì)胞培養(yǎng)基購于美國Thermofisher公司； A,B,C無血清細(xì)胞培養(yǎng)基均為國產(chǎn)培養(yǎng)基； 聚醚酰亞胺(PEI， 貨號23966-2)購于美國Polysciences公司； PD-L1蛋白購于北京義翹神州公司； 羊抗人IgG-HRP和TMB(3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺)底物顯色液購于北京索萊寶公司； 無內(nèi)毒素大提試劑盒購于北京天根生化科技有限公司.

1.2 方 法

1.2.1 HEK293 6E細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng) 在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài): 取20 μL細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行計數(shù), 確定活率>90%, 細(xì)胞密度為0.8～1.0×106個/mL. 將細(xì)胞稀釋至0.5×106個/mL培養(yǎng)， 搖瓶中的培養(yǎng)液體積為培養(yǎng)瓶總體積的20%. 標(biāo)記細(xì)胞類型、代次、日期和來源后, 將培養(yǎng)瓶放入CO2搖床(瑞士Infors公司), 于120 r/min, 37 ℃,φ(CO2)=5%懸浮培養(yǎng). 細(xì)胞培養(yǎng)的傳代密度不大于2.0×106個/mL.

1.2.2 無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取 按照無內(nèi)毒素大提試劑盒說明書操作.

1.2.3 HEK293 6E細(xì)胞生長培養(yǎng)基的篩選 將HEK293 6E細(xì)胞通過FreeStyleTMF17,A,B,C無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng), 每天記錄活細(xì)胞密度、細(xì)胞活率， 并觀測細(xì)胞的生長周期.

1.2.4 HEK293 6E表達(dá)培養(yǎng)基的篩選及抗體蛋白表達(dá) 以FreeStyleTMF17和A無血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染, 每天記錄活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活率, 并收集細(xì)胞表達(dá)的上清液, 用ELISA方法檢測抗體蛋白的質(zhì)量濃度.

1.2.5 PD-L1抗體瞬轉(zhuǎn)表達(dá)條件優(yōu)化 將表達(dá)PD-L1抗體的質(zhì)粒用PEI共轉(zhuǎn)染到 HEK293 6E細(xì)胞株中, 優(yōu)化轉(zhuǎn)染密度、質(zhì)粒DNA與PEI的質(zhì)量比及最佳收獲時間等實驗條件. 將轉(zhuǎn)染密度稀釋為1×106,2×106,4×106個/mL. 每天記錄活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活率, 并收集細(xì)胞表達(dá)的上清液, 用ELISA方法檢測抗體蛋白的質(zhì)量濃度. 將篩選的最佳轉(zhuǎn)染密度用于篩選DNA與PEI的質(zhì)量比. 先設(shè)定m(DNA)∶m(PEI)=1∶1,1∶2,1∶5,2∶1,3∶1, 再進(jìn)行轉(zhuǎn)染, 每天記錄細(xì)胞活率和活細(xì)胞數(shù), 并離心細(xì)胞上清液. 用ELISA檢測細(xì)胞上清液中抗體蛋白的表達(dá)量, 以確定最佳收獲時間.

1.2.6 抗體蛋白的純化及ELISA鑒定 將收獲的細(xì)胞培養(yǎng)上清液經(jīng)Protein A親和層析柱純化. 先用10倍柱體積的結(jié)合緩沖液(20 mmol/L Na2HPO4, 0.15 mol/L NaCl, pH=7.0)平衡層析柱; 再上樣, 樣品為經(jīng)過離心及0.45 μm濾膜過濾的細(xì)胞表達(dá)上清液, 流速為1 mL/min; 最后加入洗脫緩沖液(0.1 mol/L甘氨酸鹽酸緩沖液, pH=2.7)洗脫. 用4 mL EP管收集洗脫的樣品, 2.4 mL/管, 每個EP管內(nèi)需預(yù)先加入中和緩沖液(pH=9.0, 1 mol/L Tris-HCl)600 μL. 用SDS-PAGE蛋白電泳膠進(jìn)行分析. 利用30 000蛋白超濾管濃縮, 將SDS-PAGE電泳圖中的蛋白通過Quantity One軟件進(jìn)行純度測定. 利用間接ELISA法定量抗體的質(zhì)量濃度. PD-L1蛋白溶于包被液中包被96孔板, 于4 ℃過夜, 磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗滌96孔板3次后, 用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的牛血清蛋白(BSA)的包被液封閉2 h, 以純化已知質(zhì)量濃度的PD-L1抗體為標(biāo)準(zhǔn)抗體, 加入連續(xù)稀釋的樣品, 在37 ℃溫育1 h后, 與羊抗人IgG-HRP結(jié)合, 最后TMB顯色, 用2 mol/L H2SO4終止. 用酶標(biāo)儀檢測450～650 nm處的吸光度, 并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.

2 結(jié)果與討論

2.1 HEK293 6E細(xì)胞生長培養(yǎng)基的篩選

采用A,B,C及FreeStyleTMF17四種無血清細(xì)胞培養(yǎng)基對HEK293 6E細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng), 細(xì)胞的生長變化如圖1所示. 由圖1可見: 在B和C無血清細(xì)胞培養(yǎng)基, 隨著培養(yǎng)時間的增長, HEK293 6E細(xì)胞的細(xì)胞活率顯著下降, 活細(xì)胞數(shù)緩慢增長后下降； 在FreeStyleTMF17和A無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中, HEK293 6E細(xì)胞隨培養(yǎng)時間的增長而增多, 細(xì)胞倍增時間分別為37,33 h, 細(xì)胞活率最高均大于95%, 活細(xì)胞數(shù)在第6天達(dá)到最高， 為5.81×106個/mL. 表明HEK293 6E細(xì)胞更適合在FreeStyleTMF17和A無血清生長液中懸浮培養(yǎng). 因此選擇FreeStyleTMF17和A無血清培養(yǎng)基在轉(zhuǎn)染實驗中作為表達(dá)培養(yǎng)基, 進(jìn)而比較瞬時轉(zhuǎn)染PD-L1抗體的表達(dá)量.

圖1 在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的HEK293 6E細(xì)胞的活細(xì)胞密度(A)和細(xì)胞活率(B)Fig.1 Cell densities (A) and sell viability (B) of HEK293 6E cells cultured in different culture media

2.2 HEK293 6E表達(dá)培養(yǎng)基的篩選及抗體蛋白表達(dá)

在FreeStyleTMF17和A無血清培養(yǎng)基中表達(dá)抗體, 每天記錄活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活率, 并收集細(xì)胞表達(dá)的上清液, 用ELISA方法檢測抗體蛋白的質(zhì)量濃度， 結(jié)果如圖2所示. 由圖2可見： 兩種表達(dá)培養(yǎng)基中抗體的表達(dá)量均隨細(xì)胞數(shù)目的增加而增加, 在第5天表達(dá)量最高; FreeStyleTMF17培養(yǎng)基中最高活細(xì)胞密度為3.99×106個/mL, 表達(dá)量為60.7 μg/mL; A培養(yǎng)基中最高活細(xì)胞密度為5.59×106個/mL， 表達(dá)量為83.2 μg/mL， 并且A培養(yǎng)基價格低廉, 因此在后續(xù)實驗中均選用A無血清培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng).

圖2 FreeStyleTMF17和A培養(yǎng)基中HEK293 6E細(xì)胞的細(xì)胞密度(A)、細(xì)胞活率(B)及1～7 d的PD-L1抗體質(zhì)量濃度(C)Fig.2 Cell densities (A), cell viability (B) and 1—7 d PD-L1 antibody mass concentrations (C) of HEK293 6E cells in FreeStyleTMF17 and A culture media

2.3 PD-L1抗體瞬轉(zhuǎn)表達(dá)條件優(yōu)化

將轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度稀釋為1×106,2×106,4×106個/mL, 每天記錄活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活率, 并收集細(xì)胞表達(dá)的上清液, 用ELISA方法檢測抗體蛋白的質(zhì)量濃度, 結(jié)果如圖3所示. 將篩選最佳轉(zhuǎn)染的細(xì)胞密度用于篩選DNA與PEI的質(zhì)量比. 設(shè)定m(DNA)∶m(PEI)=1∶1,1∶2,1∶5,2∶1,3∶1, 每天記錄活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活率, 并收集細(xì)胞表達(dá)的上清液, 用ELISA方法檢測抗體蛋白的質(zhì)量濃度, 結(jié)果如圖4所示. 由圖3和圖4可見, 當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度為2×106個/mL時, 抗體表達(dá)量達(dá)到最高， 為132.8 μg/mL, 其中m(DNA)∶m(PEI)=1的細(xì)胞活率和抗體表達(dá)量最理想, 第4天表達(dá)量最高, 為170.9 μg/mL. 即細(xì)胞密度為2×106個/mL,m(DNA)∶m(PEI)=1為最佳轉(zhuǎn)染條件, 第4天為最佳收獲時間, 其PD-L1抗體表達(dá)量為未經(jīng)轉(zhuǎn)染抗體表達(dá)量的2倍.

圖3 不同轉(zhuǎn)染密度的活細(xì)胞密度(A)、細(xì)胞活率(B)及PD-L1抗體質(zhì)量濃度(C)隨轉(zhuǎn)染時間的變化Fig.3 Cell densities (A), cell viability (B) and PD-L1 antibody mass concentrations (C) of different transfection densities varied with transfection time

圖4 DNA和PEI不同質(zhì)量比的活細(xì)胞密度(A)、細(xì)胞活率(B)及PD-L1抗體質(zhì)量濃度(C)隨轉(zhuǎn)染時間的變化Fig.4 Cell densities (A), cell viability (B) and PD-L1 antibody mass concentrations (C) of different mass ratios of DNA and PEI varied with transfection time

2.4 抗體蛋白的純化及ELISA鑒定

PD-L1抗體經(jīng)Protein A親和層析柱純化后, 用SDS-PAGE凝膠電泳分析純度, 結(jié)果如圖5所示. 樣品及結(jié)合緩沖液pH=7.0. 由圖5(A)可見, 洗脫峰在280 nm處吸收值較高, 表明有蛋白洗脫； 由圖5(C)可見, 還原性條件1,2泳道均得到2個條帶, 分別在50 000,25 000附近, 與抗體輕鏈和重鏈分子量相符, 其純度大于90%. 經(jīng)ELISA鑒定, 濃縮后PD-L1抗體質(zhì)量濃度為3 mg/mL.

圖5 純化PD-L1抗體的紫外光譜(A)、電導(dǎo)率和pH值(B)及其SDS-PAGE凝膠電泳圖(C)Fig.5 UV spectrum (A), conductivity and pH value (B) and SDS-PAGE gel electrophoresis (C) of purified PD-L1 antibody

綜上, 本文篩選了適合HEK293 6E細(xì)胞最佳的生長和表達(dá)培養(yǎng)基, 使表達(dá)量提高至83.2 μg/mL, 在此基礎(chǔ)上優(yōu)化瞬時轉(zhuǎn)染條件. 結(jié)果表明， 當(dāng)轉(zhuǎn)染密度為2×106個/mL,m(DNA)∶m(PEI)=1時為最佳瞬轉(zhuǎn)條件, 第4天為最佳收獲時間, 使表達(dá)量提高至170.9 μg/mL. 通過對其表達(dá)的PD-L1抗體進(jìn)行純化及ELISA鑒定, 得到了純度大于90%的PD-L1抗體, 可滿足后續(xù)抗體研究的需求, 成功建立了一個成本低、操作便利的PD-L1抗體瞬時表達(dá)體系.