羊源雷氏普羅威斯登菌的分離鑒定

曹瑞勇，聶 鑫，李國華，杜 麗，王鳳陽

（海南大學，海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室/海口市動物基因工程重點實驗室，海南 ?？?570228）

普羅威登斯菌（Providencia spp）是革蘭氏陰性菌，屬于腸桿菌科。包括產堿普羅維斯登菌（P.alcalifaciens）、雷氏普羅威登斯菌（P.rettgeri）、拉氏普羅威登斯菌（P.rustigianii）和斯氏普羅威登斯菌（P.stuartii）[1-2]。該菌是一種條件致病性的人畜共患病原菌，能引起腹瀉、腸道外感染和尿道感染等疾病[3]。也屬于人畜共患病病原，是可以污染食物造成中毒的食物伴侶菌，并且極易產生耐藥性[4]。Williams G J等[5]曾從鱷魚巨蜥的肺組織中分離到雷氏普羅威登斯菌；2017年芮萍等[6]對臨床表現為腹瀉仔豬，進行致病菌的分離鑒定，結果表明：該病原菌為雷氏普羅維登斯，并且耐藥廣泛。

本文從海南某黑山羊養殖場患病山羊鼻腔內分離到了該菌，為海南黑山羊疾病的診斷和治療奠基了基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料 海南省某黑山羊養殖場黑山羊鼻腔分泌液。

1.2 主要試劑TSA、TSB培養基，購自美國BD公司；麥康凱瓊脂培養基、生化鑒定管和生化鑒定試紙，均購自廣東環凱微生物有限公司；DNA回收純化試劑盒，購自Takara寶生物工程（大連）有限公司；2×Taq PCR MasterMix，D2000 marker，均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 病料采集采集于海南某黑山羊養殖場病羊鼻拭子。病料采集前用75%酒精徹底消毒病羊的鼻孔周圍，用一次性無菌棉簽在鼻孔深處再次旋轉以蘸取鼻腔分泌液，將棉簽折斷放于無菌試管中，于4℃保存，以備試驗處理。

1.3.2 細菌分離培養 將采集的鼻拭子，放于無菌的生理鹽水中，37℃劇烈震蕩30 min，吸取0.2 mL加入到TSB液體培養基中，于37℃恒溫培養18～24 h后作為增菌液。吸取適量的增菌液，做革蘭氏染色。將增菌液接種于麥康凱培養基和TSA，37℃恒溫培養18～24 h，觀察菌落生長情況。在平板上挑取形態一致、優勢的菌落，進行反復劃線數次，純化菌株。再挑取單個菌落經革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察細菌的形態及染色特點。

1.3.3 生化反應特性參照姚火春等[7-8]的方法進行生化反應試驗，參照試劑盒說明書操作后，在37℃恒溫培養箱培養18～24 h，結果見表1。

1.3.416 S rRAN鑒定采用菌落PCR方法，用崔穎鵬等[9]設計的引物序列，為1 465 bp。

表1 引物序列Table 1Primer sequence

在離心管中加入300 μL無菌水，接種環菌苔至管中，振蕩，沸水浴10 min，10 000 g離心5 min，取上清為模板[10]，PCR擴增16S rDNA，反應體系：10×Buffe 2.5 μL，dNTP各1 mmoL，Taq聚合酶1.5 U，上下游引物各 0.5 μL（0.2 μmoL），細菌DNA模板0.5 μL，加蒸水至25 μL；反應條件：94℃4 min預變性；94℃45 s、55℃45 s、72℃1 min，循環30次，72℃10 min修復延伸[11]。用凝膠成儀拍照保存。

2 結果和分析

2.1 細菌分析情況和革蘭染色鏡檢結果在TSA平板上菌落呈表面光滑、邊緣整齊的無色半透明圓形菌落；在麥康凱培養基上形成淺橙色菌落。挑取單一菌落進行革蘭氏染色，用油鏡觀察。觀察結果：革蘭氏陰性、兩端鈍圓、球桿菌（如圖1）。

圖1 分離菌株的革蘭氏染色Fig.1Gram stain of the isolated strain

2.2 生化鑒定結果將分離菌株按照生化鑒定管說明書操作完成，結果如表2。

表2 生化鑒定試驗結果Table 2Biochemical identification results

2.316 SrRAN鑒定結果與鑒定PCR反應產物大小為1 465 bp，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。紫外燈下觀察結果和試驗預期結果一致（如圖2）。

按照DNA回收純化試劑盒方法回收純化陽性PCR產物，送上海生工生物技術服務有限公司進行測序，測序結果在Nucleotide BLAST，與雷氏普羅威登斯菌（KC456547.1）同源性達到99%。

圖2 16S rRNA擴增結果Fig.2 Amplification product of 16S rRNA

3 討論

雷氏普羅威登菌（Providencia rettgeri）是革蘭氏陰性菌，屬于腸桿菌。在人上主要可致泌尿道感染和其他的腸道外感染。2006年衛生部把它列入人與人間傳染的病原微生物名錄。根據報道，食物在加工、運輸、銷售過程中很容易受該菌污染，引起食物中毒事件多有發生。本菌為腐敗菌，耐低溫，可以在低溫儲存的食品中存活，尤其是夏季天氣炎熱更易造成該菌的大量繁殖，造成食物腐敗，人在食用該菌污染的食物后會出現食物中毒現象，國內報道，從肉類食品中分離到的雷氏普羅威登斯菌可能沿著食物鏈向人類傳播，給人類生命安全造成很大威脅[12]。雷氏普羅威登菌是一種條件致病菌，可引起人和動物發病。1997年戰文斌等[7]首次從國內發病的對蝦中分離出該菌，并在實驗室人工感染對蝦成功，說明該菌對海水養殖動物有致病性。2001年，范紅結等[13]從病鱉干酪樣壞死的臟器中分離到雷氏普羅威登菌，用該菌接種健康鱉，引起發病死亡，證實該菌有致病性。

本試驗在臨床中通過對細菌的分離培養、細菌形態學、生化試驗、分子生物學等技術手段，最終確定分離菌株為雷氏普羅威登斯菌。該菌可能因為天氣突然變化、動物免疫力下降等原因感染動物，為臨床疾病治療提供了參考資料。為臨床患呼吸道疾病、敗血癥、尿道感染、混合感染病羊的治療提供了新的思路和方案，也給養殖人員敲響了人畜共患疾病風險的警鐘。