盤錦地區候鳥禽流感調查研究

印寶東，楊 曼，溫書志，李 紅，李 雪，張 彬，王麗杰，劉 野

（1.遼寧省盤錦市動物疫病控制中心，遼寧 盤錦 124013；2.遼寧省盤錦市盤山縣動物疫病預防控制中心，遼寧 盤山 124100；3.遼寧省盤錦市盤山縣電商物流產業管理中心，遼寧 盤山 124100；4.遼寧省盤錦市大洼區動物疫病預防控制中心，遼寧 盤錦 124200；5.遼寧省盤錦市濕地保護管理中心，遼寧 盤錦 124013）

禽流行性感冒，簡稱禽流感（Avian Influenza，AI），是由A型流感病毒引發的以感染禽類為主的傳染病，世界動物衛生組織（OIE）將其列為A類動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。雞、火雞、鴨、鵝和鵪鶉等家禽及野鳥、水禽、海鳥等均可感染禽流感病毒。野生鳥類是禽流感病毒的天然宿主，帶毒候鳥可能隨著遷徙將禽流感病毒傳播到世界各地[2]。雙臺河口保護區濕地總面積8萬公頃，丹頂鶴、黑嘴鷗等260多種鳥類在這里棲息、繁殖。在東亞至澳大利亞候鳥遷徙路線上起著重要中轉站的作用[4]。多年來，本課題組密切關注雙臺子河口濕地遷徙、棲息的野生鳥類情況，通過持續監測候鳥攜帶禽流感病毒情況并對病毒開展分子流行病學分析，為尋找我國禽流感病毒傳播規律提供數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 H5、H7、H9、A型流感病毒通用型熒光RT-PCR檢測試劑盒購自凱杰（匹基）生物工程（深圳）有限公司，高速冷離心機為德國，熒光PCR儀購自美國、生物安全柜為德國、移液器為美國，離心管、移液器槍頭等常規耗材為進口。

1.2 樣品采集根據遼河河口自然保護區整個調查范圍內的具體地貌、地勢和濕地分布情況，將樣品監測采集范圍劃分為15個具有明顯可識別邊界的小區（見圖1）。在每個監測小區中，選擇一處視野開闊的觀察點，對監測范圍內水禽進行逐一識別和統計、記錄。樣品采集對象為監測時段內所見到的所有自然界活動的野鳥，結合日常巡查針對撿拾死鳥尸體、合法捕獲進行人工飼養的鳥類進行檢測。隨時到合法飼養舍采集棉拭樣品和到候鳥集中棲息場所采集野鳥新鮮糞便樣品。根據春秋季節本區鳥類遷徙的特點，春季監測時間主要集中在北遷雁鴨類、鶴鸛類和鸻鷸類遷徙高峰期，采樣時間集中在2月底～5月底；秋季監測時間主要集中在南遷雁鴨類、鶴鸛類和鸻鷸類遷徙高峰期，采樣時間在7月下旬～11月下旬；每月開展1次采樣。采集的糞便或拭子樣品放入含10%甘油的PBS緩沖液中。

圖1 遼寧雙臺河口自然保護區監測區分區圖[5]Fig.1Liaoning Shuangtaihekou natural reserve monitoring area partition diagram

表1 遼河口濕地樣品采集點分布Table 1Liaohekou wetland Sample collection point distribution

1.3 樣品檢測

1.3.1 檢測前樣品處理采集的糞便或拭子樣品保存管用振蕩器充分震蕩，讓拭子或糞便充分與緩沖液混合，然后小型臺式高速離心機12 000 r/min離心2 min，取上清用于樣品核酸提取。

1.3.2 樣品核酸提取 按照試劑盒說明書，每個樣品取200 μL（同時設立陽性和陰性對照樣品），加入600 μL裂解液，混勻，然后加入200 μL氯仿，混勻，4℃12 000 g離心15 min，取上清至另一個1.5 mL離心管中，加入400 μL的異丙醇，顛倒混勻。12 000 g離心15 min，棄上清，用600 μL 75%乙醇洗滌1次，離心棄上清，倒立離心管，自然烘干，每個樣品加11 μL的無RNA酶的DEPC水溶解RNA沉淀。-20℃保存備用。

1.3.3 熒光定量PCR檢測按照試劑盒說明書，在各設定的PCR管中分別加入上述樣本處理中制備的RNA溶液各10 μL，蓋緊管蓋，將PCR管排好放入PCR熒光檢測儀內，進行檢測，RT-PCR循環參數如下：42℃30 min，92℃30 min，1個循環；92℃10 s，45℃30 s，72℃1 min，5個循環；92℃10 s，60℃30 s，40個循環。

1.4 陽性樣品的病毒分離鑒定對實驗室檢測陽性的樣品送到國家禽流感參考實驗室進行病毒分離鑒定，病毒分離陽性的樣品進行序列測定和分析。

2 試驗結果

2.1 樣品采集情況自2012年至2017年在雙臺子河口自然保護區的濕地、救助站內、葦田等區域采集了4 278份樣品，其中野鳥樣品棉拭384份、野鳥尸體臟器39份、環境水樣500份、糞便3 355份，采集的樣品存放于含有PBS甘油的緩沖液系統內，-20℃保存備用。

2.2 樣品檢測結果采用凱杰（匹基）生物工程（深圳）有限公司提供的熒光定量PCR檢測試劑盒對提取的核酸進行檢測，首先用通用型試劑盒檢測樣品中M基因的存在與否，來判定樣品中是否含有禽流感病毒，檢測結果發現在4 278份樣品中有7份為流感監測陽性，分別用H5、H7和H9亞型禽流感檢測試劑盒進行亞型鑒定發現這5個樣品中有2個為H9陽性，2個為H5陽性，有1份樣品該三種試劑盒為陰性。

2.3 陽性樣品鑒定將該批檢測陽性樣品送到參考實驗室進行檢測，反饋結果表明：沒有鑒定出亞型的樣品為H6亞型禽流感病毒，對檢測陽性的H5樣品進行病毒分離鑒定發現為H5N8或H5N2亞型，共鑒定出1株H5N8病毒亞型，1株H5N2病毒亞型，H5亞型禽流感病毒進化分支為2.3.4分支，與韓國流行病H5N8毒株的HA基因相似性為99.5%，高度同源。

表2 2012～2017年不同時間監測野鳥禽流感陽性分布Table 22012～2017 different time surveillance of wild birds avian influenza positive distribution

3 討論

雙臺河口保護區濕地作為多種野鳥的重要的棲息、繁殖地，同時也是世界上重要的候鳥遷徙帶。該濕地區域是東亞至澳大利亞候鳥遷徙路線上的一個重要中轉站，特殊的地理位置、良好的生態環境和特殊植被類型養育著豐富的動物資源，是多種鳥類的理想棲息繁殖地和遷徙停歇地。這里是世界上最大的黑嘴鷗繁殖地，分布有黑嘴鷗12 000余只，其繁殖種群10 000余只，是名副其實的“黑嘴鷗之鄉”。眾所周知，野鳥作為禽流感病毒的最大天然宿主庫，在維持流感病毒的多樣性方面起著重要的作用。隨著候鳥的遷徙，禽流感病毒也隨著感染的野鳥不斷移動，并隨著野鳥的生活活動以及糞便的排放而污染野鳥活動的區域環境，由于自然界中野鳥的活動區域和水禽的活動區域有著較大的重疊，容易導致病毒進入水禽。是當前家禽感染禽流感病毒的一個重要風險來源。

在盤錦市轄區范圍內，水禽的飼養量較大，尤其是散養家禽較大，可以多達380萬羽，給候鳥與家禽之間增加了一個較大的密切接觸機會。韓國2014年前后連續多次發生禽流感疫情也表明，野鳥給該遷徙路線上的家禽帶來巨大的禽流感感染風險。本研究通過對盤錦地區野生鳥類進行長達5年的禽流感監測發現，不同時間和季節，野鳥攜帶的禽流感種類也不盡相同，野鳥可以攜帶多種不同的病毒，也可能攜帶傳播高致病性的禽流感病毒。通過對分離H5亞型禽流感病毒的HA基因的序列比較可以發現研究分離株的大多數基因與韓國毒株的親緣關系較近,說明在韓國和中國之間流感病毒通過候鳥存在頻繁的基因交流和交換。

從監測結果看，家禽H5病毒感染與候鳥之間可能存在一定關聯，加強候鳥感染情況的調查與監測，對做好高致病性禽流感預警預報工作具有促進和指導作用。同時在家禽飼養管理方面應注意做好圈舍的密封防護，安裝防鳥網設施，以及生物安全防隔離設施等，按程序做好免疫、定期開展消毒，嚴防病毒傳給家禽。每年數十萬只的野鳥于此停歇、棲息或繁殖，足以說明雙臺河口自然保護區在亞太地區野鳥保護上的重要位置，盤錦作為我國研究流感病毒傳播的前沿陣地具有重要的代表性，對公共衛生安全也具有實際意義。