荷斯坦牛BoLA-DRA基因外顯子1生物信息學分析

付保強，虎紅紅，劉麗霞

（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030)

主要組織相容性復合體（Major Histocompatibility Complex，MHC）是動物機體中緊密連鎖的不平衡的基因復合體[1]，其在機體免疫應答、抗原識別和機體調控中發揮著重要作用[2]，編碼產物為MHC抗原分子，與動物機體免疫疾病存在緊密聯系性[3-6]。Acosta-Rodrguez等[7]于2005年報道了牛MHC并將其命名為牛白細胞抗原系統（Bovine lymphocyte antigen，BoLA）。荷斯坦牛BoLA基因位于牛的23號染色體上，主要是由三類基因組成，分別為Ⅰ類分子、Ⅱ類分子和Ⅲ類分子，其中Ⅱ類分子主要為異源雙體膜糖蛋白，其被劃分為Ⅱa、Ⅱb兩個亞區，DRA是Ⅱ類分子Ⅱa亞區的基因，為MHC分子進行編碼，具有高度多態性[8-11]。由于荷斯坦牛BoLA-DRA能夠引起抗原抗體反應降低牛乳房炎等免疫疾病的發生，使其成為了荷斯坦?？共×Φ牧己梅肿雍蜻x基因之一。近年來，研究者對荷斯坦牛BoLA基因的功能、多態性及其與免疫功能和疾病的相關性做了大量研究，高樹新（2005）[12]通過對不同牛BoLA基因研究發現其具有高度多態性且對奶牛乳房炎具有致病性。王興平（2004）[13]通過對四種黃牛為研究采用PCR-RFLP和SSCP方法，結合克隆測序分別研究了MHC的DRA基因第二外顯子和DRB3基因第二外顯子的分子遺傳變異，并運用最小二乘線性模型，對所發現多態位點與牛的生產性狀進行了相關分析，結果發現其與牛的生產性能高度相關。楚秋霞等（2013）[14]通過運用生物信息學對南陽牛BoLA-DRA編碼蛋白區的理化性質和結構特征進行分析，結果發現DRA基因與其他物種核苷酸序列的同源性均在90%以上，進一步表明該基因與疾病性狀存在相互作用關系。李彥清等（2015）[15]在對牦牛和普通牛BoLA-DRA*Exon2-intron2多態性分析比較后發現牦牛DRA基因第2外顯子區堿基序列與普通牛以及山羊的同源性最高，系統進化情況與它們親緣關系遠近一致。這些研究都表明BoLA-DRA基因在控制機體免疫調控方面具有重要作用，但是前人對BoLA-DRA基因大多數研究主要集中在外顯子2以及其他內含子，但是對于荷斯坦牛BoLA-DRA基因中1～93位的外顯子1生物信息學研究未見報道。

本研究以荷斯坦牛為研究對象，通過構建DNA混合池，擴增后對其進行測序的方法對荷斯坦牛Bo-LA-DRA基因外顯子1進行生物信息學分析，旨在為研究該基因理化特性、結構功能、免疫調節機制提供必要的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和DNA混合池的構建本研究血樣采自寧夏農墾賀蘭山奶業有限公司，從300頭處于泌乳期荷斯坦牛中用醫用采血管尾靜脈采血10 mL，利用傳統的酚-氯仿抽提法荷斯坦牛血液總基因組DNA[16]，-20℃保存備用。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取效果，隨機抽取30個效果良好的樣品各取1 μL構建DNA混合池。

1.2 引物設計和PCR擴增測序根據NCBI數據庫中荷斯坦牛BoLA-DRA基因序列（GenBank:M30120.1），利用在線軟件Primer-BLAST對荷斯坦牛BoLA-DRA基因外顯子1設計1對的特異性引物，在BoLA-DRA基因中處在1～93位的外顯子1預期擴增片段長度為161 bp，引物序列分別為：F1:5'-CACCAAAGAAGAAAA TGGCC-3',R1:5-CCACAGTTCATTTCTCCGAAGC-3'上引物序列設計好后送至蘇州金唯智生物科技有限公司完成。PCR擴增體系20 mL：DNA模板0.8 μL，上、下游引物各0.4 μL，2×Power Taq PCR Master Mix 11 μL，ddH2O 7.4 μL。PCR條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，57.6℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30個循環；72℃延伸10 min，4℃保存，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行檢測，紫外分光光度計檢測。將擴增產物進行回收純化后，送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行PCR產物測序。

1.3 生物信息學分析軟件通過對荷斯坦牛BoLADRA基因外顯子1擴增產物的序列測序，運用RNA fold web server在線服務器（http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）預測mRNA二級結構，運用軟件（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sop ma.html）預測蛋白質的二級，利用Protfun在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）分析預測蛋白質的功能。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果荷斯坦?；駼oLA-DRA外顯子1 PCR擴增產物片段大小在160 bp左右，預期目的片段長度大小相符，且條帶明亮清晰、特異性良好，如圖1所示。2

圖1 荷斯坦?；駼oLA-DRA外顯子1 PCR擴增結果Fig.1PCR amplification Results of BoLA-DRA exon 1 in Holstein gene

2.2 測序結果分析通過對荷斯坦牛DRA外顯子1基因進行測序分析發現，存在1個插入位點（exon1-1T^2）測序峰圖如圖2和3所示。

圖2 荷斯坦牛DRA基因外顯子1測序峰圖Fig.2The sequence peak diagram of exon 1 of DRA gene

2.3 mRNA二級結構預測結果通過運用在線軟件對荷斯坦牛DRA外顯子1插入位點mRNA二級結構進行預測，結果如圖4所示，發現外顯子1堿基插入之后自由能與突變前相同，該插入沒有改變DRA外顯子1mRNA的二級結構如圖4所示。

圖3 測序結果序列與基因庫序列比較圖Fig.3 Comparison chart of sequencing result sequence and gene pool sequence

圖4 荷斯坦牛DRA基因外顯子1 mRNA二級結構圖Fig.4 Exon 1 mRNA secondary structure of the DRA gene in Holstein

2.4 蛋白質的二級結構預測荷斯坦牛DRA外顯子1的插位點為錯義突變，因為外顯子1在DRA基因序列的1～93位，但編碼區只有15～93位點，插入位點不在編碼區上，未造成氨基酸改變，突變前后蛋白質二級結構相同，同時也不會影響蛋白質的結構功能。預測結果顯示，荷斯坦牛DRA外顯子1蛋白質二級結構由α-螺旋（30.77%）、β-折疊（34.62%）、β-轉角（11.54%）、無規則卷曲（23.08%）組成，其中β-折疊占比例最高。

2.5 蛋白質的功能預測與分析荷斯坦牛DRA外顯子1從預測結果可以看出編碼蛋白質的荷爾蒙和免疫應答的含量相對較高，其幾率分別為21.057和3.546，荷爾蒙的幾率最高，免疫應答次之，據此可以推斷荷斯坦牛DRA基因外顯子1在牛的性激素和免疫應答過程中起著重要的作用。

3 討論

MHC基因是指脊椎動物某一染色體上編碼主要組織相容性抗原、控制細胞間相互識別、調節免疫應答的一組連鎖的基因群，其具有高度多態性，與動物自身免疫疾病存在密切關系BoLA-DRA基因是奶牛MHC基因中的一個編碼基因，目前國內對于BoLA-DRA基因的研究主要集中在DRA基因的多態性上分析上，蒲蘭屏等（2012）[17]通過運用生物信息學對比不同牛的基因，發現與MHC家族其他基因不同DRA基因在所有的動物尤其是反芻動物中表現出高度保守，包括肽結合部位（PBS）、N-糖原區、α1、α2區等功能部位都呈現出高度保守。高樹新等（2008）[18]發現兩種兼用型在研究DRA外顯子2時發現在感染乳房炎牛中CC基因型頻率最高，在健康牛中BC基因型頻率最高，結果表明牛乳房炎抗性和易感性可能與牛的基因型有密切關系。前人對于外顯子1的研究還未見報道，本研究主要對荷斯坦牛BoLA-DRA外顯子1的擴增產物經過測序發現在第一位堿基C和第二位堿基A之間有堿基T的插入，但是沒有影響mRNA的二級結構的變化，并且在發生突變前后自由能的大小相同，出現的原因可能是因為此堿基的插入為錯義突變，但因為插入位點不在編碼區，不會引起氨基酸結構功能以及蛋白質結構功能的變化，所以對于荷斯坦牛BoLA-DRA基因外顯子1高級結構和功能未發生變化。功能預測結果表明，該基因可能在荷爾蒙的產生和免疫應答過程中起著重要的作用，研究結果可為荷斯坦牛BoLA-DRA基因外顯子1功能的研究提供科學理論依據。

表1 荷斯坦牛DRA基因外顯子1蛋白質的功能預測與分析Table 1 Functional prediction and analysis of exon 1 protein in Holstein DRA