水稻條紋葉和白穗基因SLWP的定位及變異分析

周坤能 夏加發 馬廷臣 王元壘 李澤福

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水稻條紋葉和白穗基因的定位及變異分析

周坤能 夏加發 馬廷臣 王元壘 李澤福*

(安徽省農業科學院 水稻研究所, 安徽省水稻遺傳育種重點實驗室, 國家水稻改良中心合肥分中心, 合肥 230001；*通訊聯系人, E-mail: lizefu@aliyun.com)

【目的】對葉綠體發育相關基因進行克隆和功能分析，為解析葉綠體功能奠定分子基礎。【方法】用甲基磺酸乙酯(EMS)處理秈稻9311獲得一個條紋葉和白穗突變體，通過色素分析和農藝性狀觀察分析該突變體的表型，通過圖位克隆方法分離該基因，進一步利用定量PCR分析相關基因的表達情況。【結果】突變體從2葉期開始至抽穗期表現出條紋葉表型，抽穗后幼穗白化，光合色素含量明顯低于野生型；株高降低、抽穗延遲、產量降低等表型。該突變性狀為單隱性核基因控制，該基因定位于水稻第6染色體短臂C6-4和N14標記之間0.91 Mb區間內。基因組測序表明核糖核苷二磷酸還原酶小亞基基因()編碼區第776位點發生單堿基替換，導致甘氨酸突變為天冬氨酸；該基因與已報導的水稻基因、和為等位基因。通過對這4個等位基因的突變位點和表型進行分析，總結了該基因不同位點突變對植株表型的影響以及秈粳之間的差異。表達分析顯示與葉綠素合成有關的基因受到不同程度調控，葉綠體發育第一和第二階段基因上調表達，光合作用相關基因均下調表達。【結論】本研究分析了()基因不同位點的變異對水稻表型的影響，相關結果加深了對基因功能的認識，有助于闡明葉綠體發育的分子機制。

水稻；突變體；變異分析；表達分析

葉綠素廣泛存在于綠色高等植物、綠藻、藍細菌等光合生物中，作為主要的光受體色素參與植物的光合作用[1]；類胡蘿卜素參與穩定光系統并使植株避免受到光傷害[2,3]。葉綠素缺失突變體是研究葉綠素合成、葉綠體發育和光合作用等的理想材料。參與葉片中葉綠素合成途徑中的基因已被明確鑒定[4]，然而，葉綠素代謝是一個復雜的代謝過程，仍有許多調控基因還未被鑒定。

水稻條紋葉表型受多個基因調控，其分子生物學機理較為復雜。影響葉綠體生物合成相關基因突變后造成葉片白條紋表型，研究表明水稻和基因在3葉期莖基部組織中高表達，即葉綠體發育第一階段，這兩個基因突變后影響質體DNA的合成，阻礙葉綠體分化[5]；水稻、和基因分別在葉綠體發育的第二階段高度積累，其突變影響葉綠體遺傳機制的建立，阻礙葉綠體的形成，造成水稻白條紋表型[6-10]。和屬于PPR家族蛋白，與葉綠體中RNA代謝有關，其基因突變造成、、等葉綠體轉錄本不能被正常剪切，導致葉片產生條紋[11,12]。還有一類定位于葉綠體類核中的蛋白，這些蛋白的主要功能是參與質體轉錄，調控丙酮酸羧化酶(PEP)和RNA聚合酶有關基因的表達，如和，其突變后損壞PEP活性，造成白條紋表型[13,14]。此外，編碼鉀離子通道蛋白的基因突變后亦可造成葉片白條紋表型[15]。

然而，目前關于幼穗中葉綠素合成和葉綠體發育的報道較少。李紅昌等[16]于秈粳交F6群體中獲得一個白穗突變體，并將控制該性狀的基因(t)定位于水稻第1染色體。同樣地，控制白穗相關性狀的基因和被分別定位在水稻第7染色體87 kb和第8染色體79 kb區間內[17,18]。基因編碼一個50S核糖體大亞基蛋白L13，其突變體4葉期之前顯示明顯的白化葉表型，4葉期之后至抽穗期葉片表型正常，抽穗期幼穗呈現白化表型，低溫下突變體表型更加明顯[19]。基因突變顯示兩種突變表型，嚴重時葉片白化，4葉期植株死亡；輕微時葉片從苗期至開花期表現為條紋表型，抽穗后幼穗白化；該基因編碼一個纈氨酸-tRNA合成酶，主要參與調控葉綠體核糖體的發育[20]。水稻幼苗條紋基因突變后植株在2葉期至4葉期表現出條紋表型，之后葉色正常，但在抽穗之前植株生長受到抑制，抽穗期葉片顯示輕微的條紋表型，幼穗穎殼白化，成熟后種皮仍表現出白化性狀[21]。此外，一個控制水稻條白葉和白穗性狀的基因與和為等位基因，但其在性狀上差異明顯[5,22,23]。這3個基因編碼同一個蛋白，即核糖核苷酸還原酶小亞基蛋白(RNRS1)。RNRS1是DNA復制和DNA損傷修復必不可少的酶之一，它能夠催化核苷二磷酸形成脫氧核苷二磷酸，促進脫氧核苷二磷酸的生成[24]；酵母實驗表明RNRS1能夠與核糖核苷酸還原酶大亞基蛋白(RNRL1)互作形成異源二聚體，編碼該蛋白的基因突變后減弱二聚體的形成，進而影響質體基因組的復制，抑制葉綠體的發育分化[5]。

本研究利用EMS誘變秈稻品種9311獲得一個條紋葉和白穗突變體，對其表型和農藝性狀進行了分析考查，同時對該突變基因進行遺傳分析和精細定位，并通過序列分析確定突變位點；通過突變分析揭示該基因不同位點突變對表型的影響；進一步通過表達分析明確該基因參與調控葉綠素合成、葉綠體發育以及光合作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻條紋葉和白穗突變體由EMS處理秈稻品種9311變異獲得，經過多代自交選擇，性狀穩定遺傳。

1.2 光合色素含量測定

利用分光光度計法，測定2葉期、3葉期和分蘗期不同葉片以及抽穗期穎殼中的光合色素含量。3次重復。

表1 本研究所用引物的序列

1.3 主要農藝性狀調查

將野生型和突變體同時播種移栽，種植密度為16.67 cm× 26.67 cm，種植面積為6.67 m2，各3次重復。抽穗期調查播始歷期，成熟期調查株高、穗長、有效穗數、每穗粒數、結實率、千粒重等農藝性狀，10次重復。收獲后測量實際產量，3次重復。

1.4 遺傳分析和基因定位

利用突變體與野生型9311正反交構建遺傳分析群體，種植F2群體1000~1200株，統計正常單株與突變單株的株數，利用卡方測驗進行遺傳分析。構建和農院238秈粳雜交F2群體，利用10個具有典型突變性狀的F2單株和覆蓋水稻12條染色體的SSR標記進行連鎖分析，再利用134個F2突變單株進行初定位，進一步利用851個F2突變單株并開發新的InDel標記對目的基因進行精細定位。InDel標記根據NCBI (https://www. ncbi.nlm. nih.gov/)公布的9311與日本晴的插入/缺失差異，利用軟件Primer Premier 5.0設計，基因定位引物序列見表1。利用引物slwp-g(表1)對突變體和野生型的基因組DNA進行擴增，測序獲得核糖核苷二磷酸還原酶小亞基基因(，LOC_Os06g14620)的序列差異。PCR程序為：95℃下5 min；95℃下30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸(1 min/kb)，34個循環；72℃下5 min；4℃下10 min。

1.5 序列分析和蛋白三維結構預測

利用RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)數據庫預測基因功能，用NCBI(https://www.ncbi.nlm. nih.gov/)數據庫蛋白搜索功能預測結構域，并查詢與SLWP蛋白高度同源的序列，采用Bioedit軟件進行同源比對。利用SWISS-MODEL(https://www. swissmodel.expasy.org/)軟件預測蛋白三維結構。

1.6 定量PCR分析

利用天根RNA提取試劑盒(RNA prep pure plant kit)提取3葉期突變體、野生型(9311)和中花11葉片以及抽穗初期9311和中花11幼穗中的總RNA。采用TaKaRa反轉錄試劑盒(SuperScript Ⅱ kit)反轉錄得到cDNA，于―20℃下保存備用。采用TaKaRa試劑盒(SYBR?Premix ExTMkit)和Roche定量PCR儀(LightCycler 480 Real-Time PCR System)進行定量PCR，以基因(LOC_ Os03g13170)為內參，利用2法分析結果。定量PCR引物及其序列見表1[14]。

2 結果與分析

2.1 突變體slwp的表型分析

突變體從2葉期開始表現出條紋葉表型，3葉期表型更加明顯(圖1-A)，分蘗期表型持續，各葉片顯示出不同程度的缺綠(圖1-B、C)，抽穗期植株葉鞘也表現出條紋表型(圖1-D)，同時幼穗明顯白化(圖1-E、F），成熟期野生型水稻穎殼為金黃色，而突變體穎仍為白色(圖1-G）。

A—2葉期和3葉期表型；B和C—分蘗期葉片表型；D—孕穗期葉鞘表型；E和F—抽穗期幼穗表型；G—種子表型。

Fig. 1. Phenotypic characteristics of themutant and its wild type(WT).

chla―葉綠素a；chlb―葉綠素b；a+b―總葉綠素；Car―胡蘿卜素。

Fig. 2. Pigments determination of themutant and its wild type(WT).

A—SLWP基因初定位；B—SLWP基因精細定位；C—SLWP基因結構和突變位點；ATG和TGA分別代表起始密碼子和終止密碼子。

Fig. 3. Map-based cloning of thegene.

表2 野生型和突變體的農藝性狀分析

數據結果為10次重復，來源于2015年合肥正季，種植密度為16.67 cm × 26.67 cm，種植面積為6.67 m2。**<0.01。

Values are the mean±SD from ten replications in Hefei, in 2015. The planting density was 16.67× 26.67 cm. The area per plot was 6.67 m2.**<0.01.

色素含量分析表明，2葉期和3葉期不同葉片中葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素含量明顯低于野生型，分蘗期葉片葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素含量與野生型相比分別降低了18.3%~70.5%、19.3%~72.7%、18.6%~71.1%和19.2%~68.0%(圖2-A)。抽穗期突變體穎殼葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著低于野生型(圖2-B)。

2.2 突變體slwp的農藝性狀觀察

農藝性狀調查顯示，突變體與野生型相比，其株高、穗長、每穗粒數和千粒重明顯降低，抽穗期延長，理論產量降低，實際產量不足野生型的一半；有效穗數和結實率沒有顯著差異(表2)。

2.3 SLWP遺傳分析和基因定位

構建突變體與野生型9311的正反交F2群體進行遺傳分析。F1均表現出正常的野生型表型，/9311的F2群體中正常葉色植株893株，條紋葉植株284株，卡方測驗正常葉色與條紋葉植株的分離比符合3∶1(χ2=0.476<χ20.05=3.84)，9311/的F2群體中正常葉色植株734株，條紋葉植株264株，卡方測驗正常葉色與條紋葉植株的分離比符合3∶1(χ2=1.124<χ20.05=3.84)，這些結果表明該突變性狀受單隱性核基因控制。

同時構建突變體與農院238的秈粳交F2定位群體。首先利用10個具有典型突變體表型的F2單株以及與突變表型連鎖的分子標記將目的基因初定位到第6染色體短臂，選取134個F2突變單株進行初定位，將目的基因定位于標記C6-4和C6-6之間(圖3-A)。進一步利用851個F2突變單株，開發新的InDel標記，將目的基因定位于標記C6-4和N14之間0.91 Mb區間內(圖3-B)。對該定位區間進行基因預測，發現一個與水稻葉片條紋和白穗有關的基因，即核糖核苷二磷酸還原酶小亞基基因(LOC_Os06g14620)。基因組測序顯示，在該基因編碼區的第776個堿基由G突變為A，導致甘氨酸突變為天冬氨酸(圖3-C)。

2.4 SLWP及其同源蛋白的序列分析

序列分析顯示基因編碼一個含339個氨基酸殘基的蛋白且只含有1個外顯子(圖3-C)。蛋白結構域預測發現該蛋白15－296氨基酸為核苷酸還原酶結構域，該區域高度保守。同源分析表明SLWP蛋白與其他物種如擬南芥、大豆、玉米、煙草和小立碗蘚中的同源蛋白具有很高的相似性(圖4)。

序列來源于水稻LOC_Os06g14620(SLWP)、擬南芥At3g23580、大豆XP_003547645.1、玉米NP_001130908.2、煙草NP_001312237.1和小立碗蘚XP_001768501.1；下劃線代表核糖核苷酸還原酶結構域；ST1、STWP、GWS和SLWP蛋白突變位點以紅色字體和線框標出。

Fig. 4. Alignment of SLWP and SLWP-related proteins of different organisms.

A—st1、st-wp和slwp；B—突變蛋白gws；紅色表示突變位點。

Fig. 5. Prediction of 3D structure model.

2.5 SLWP變異分析

基因與水稻中已報道的、和為等位基因，蛋白的各突變位點均在核苷酸還原酶結構域內，且都是高度保守的氨基酸序列。st1、st-wp和slwp分別在該蛋白的第40、103和259位點發生單氨基酸突變，突變后編碼一個只有118個氨基酸殘基的截斷蛋白，且105位至118位氨基酸與野生型不同(圖4)，同時利用蛋白三維結構預測SLWP蛋白及其等位突變蛋白結構，發現st1、st-wp和slwp蛋白突變分別發生在α螺旋內或靠近α螺旋位置(圖5-A)，gws蛋白嚴重缺失了該蛋白的重要結構域(圖5-B)。

表3 SLWP變異分析

SLWP蛋白不同位點突變導致不同的表型變化。由粳稻品種FL176突變而來，從4葉期或5葉期至分蘗期表現出明顯的條紋表型，抽穗后表型恢復[5]；由粳稻品種日本晴突變而來，從苗期開始直至抽穗期葉片均表現出條紋表型，其農藝性狀與野生型相比發生較大變化，其株高、穗長、分蘗數、結實率、千粒重和單株生物量均明顯降低[22]；由秈稻品種9311突變而來，從苗期至抽穗期葉片均顯示條紋表型，抽穗后幼穗白化，農藝性狀與野生型相比差異較大，其株高、穗長、每穗粒數、結實率、千粒重明顯降低，抽穗延遲，分蘗數無明顯差異[23]；突變表型與較為相似，但突變體中結實率與野生型差異不顯著(表3)。這些等位突變體在葉片中均有條紋表型，除農藝性狀不變外，其他3個突變體水稻產量均降低；此外，粳稻突變體和未出現白穗。

A—葉綠素合成相關基因表達分析；B—葉綠體發育相關基因表達分析；C—光合作用相關基因表達分析。*和**分別表示5%和1%顯著水平。

Fig. 6. Expression analysis of genes involved in chlorophyll biosynthesis, chloroplast development and photosynthesis between wild type(WT) and mutant.

2.6 葉綠素合成、葉綠體發育和光合作用相關基因表達分析

進一步利用定量方法對突變體和野生型中葉綠素合成、葉綠體發育和光合作用有關的基因進行表達分析。葉綠素合成相關基因在突變體中受到不同程度的調控，與野生型相比，NADPH原葉綠素酸酯氧化還原酶基因和葉綠素合成酶基因表達明顯上調，谷氨酰-tRNA還原酶基因和鎂離子螯合酶Ⅰ亞基基因表達下調，鎂離子螯合酶亞基基因和無顯著差異(圖6-A)；參與葉綠體分化第一階段(編碼質體分化機制原件)和第二階段相關基因(編碼NEP蛋白，和分別編碼PEP α和β亞基)表達明顯上調(圖6-B)；編碼核酮糖1,5二磷酸羧化酶大小亞基基因和、編碼光系統Ⅰ復合體亞基基因和以及編碼光系統Ⅱ復合體亞基基因，和在突變體中表達明顯下調(圖6-C)。定量PCR檢測()及其同源基因基因在粳稻中花11和秈稻9311相同時期不同組織中的表達差異，結果表明()基因在中花11和9311的幼穗和幼葉中表達差異明顯，基因在9311的幼穗和幼葉中表達水平明顯高于中花11(圖7)。

圖7 SLWP(RNRS1)和RNRS2在中花11(ZH11)、9311和slwp突變體不同組織中的表達分析

Fig. 7. Expression analysis of() andin different tissues of ZH11, 9311 andmutant.

3 討論

目前，已克隆了大量通過不同途徑參與葉片中葉綠素合成和葉綠體發育的葉色基因[5-15]。然而，影響幼穗中葉綠素合成和葉綠體發育相關基因的報道較少，其中、、以及已被克隆[19-21,23]。白穗突變體往往在苗期即顯示出明顯的白條紋性狀，抽穗期葉片呈現不同粗細的條紋。幼穗白化突變體往往株高降低，植株生長延緩，植株主要農藝性狀變差進而產量下降[21,23]。

本研究通過自然變異獲得一個幼穗白化突變體，經基因精細定位和克隆發現該基因編碼一個核糖核苷酸還原酶小亞基蛋白RNRS1，并與已報道的、和為等位基因，但突變位點不同，且在表型和農藝性狀上存在差異。從表型上來看，、和突變體從苗期至抽穗期葉片均顯示白條紋性狀，突變體葉片從4葉或5葉期至分蘗期表現白條紋，抽穗后恢復，農藝性狀上，抽穗后期與野生型無顯著差異；、和均顯示出株高、穗長、千粒重降低的表型，推測突變可能不影響核糖核苷酸還原酶結構域的功能，該突變位點可利用基因編輯技術應用于水稻育種。此外，和由粳稻品種突變得到，未顯示白穗表型，而和由秈稻品種突變而來，顯示明顯的幼穗白化。為了解釋這一現象，我們觀察F2定位群體中條紋和白穗表型情況，發現抽穗期幼穗白化與葉片條紋性狀是緊密連鎖的，初步排除秈粳遺傳背景的影響；()基因在中花11和9311的幼穗和幼葉中表達差異明顯(圖7)，暗示該基因突變后在秈粳之間的表型差異可能受其自身表達的影響；在9311的幼穗和幼葉中表達水平明顯高于中花11(圖7)，其在粳稻背景下的表達水平低于[5]，但在秈稻中的表達明顯高于(圖7)，這些數據說明在秈稻與粳稻中行使的功能可能存在較大差異，可能與秈粳之間基因突變造成的表型差異有關。在突變體中表達明顯高于野生型，而在突變體中表達明顯低野生型(圖7)，這與Yoo等[5]研究結果一致。

()在莖基部組織中高度表達，說明其在葉綠體發育第一階段，即質體分化和質體DNA合成中行使重要功能，突變體中dNTPs水平明顯低于野生型，表明中質體DNA合成受阻[5]。突變體中幼穗白化，說明在幼穗發育早期發揮作用，該基因突變可能阻礙幼穗中質體DNA的合成，進而抑制葉綠體的分化，降低葉綠素水平。葉綠素合成相關基因在中受到不同程度調控(圖6-A)，暗示可能參與調控葉綠素合成網絡；葉綠體發育第一階段和第二階段相關基因表達上調(圖6-B)，說明葉綠體發育受調控；編碼光系統Ⅰ和Ⅱ復合體亞基的基因在突變體中表達明顯下調(圖6-C)，暗示中光合作用可能受到抑制，影響農藝性狀，降低產量可能與此有關。本研究對于探索相同基因不同等位突變在不同遺傳背景下行使不同功能的原因具有重要意義。

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Mapping and Mutation Analysis of Stripe Leaf and White Panicle Genein Rice

ZHOU Kunneng, XIA Jiafa, MA Tingchen, WANG Yuanlei, LI Zefu*

(,//-,,;*Corresponding author,-:.)

【Objective】Cloning and function analysis of chloroplast development-associated genes will lay a molecular basis for clarifying chloroplast function. 【Method】A stripe leaf and white panicle mutant,, was isolated from an ethylmethylsulfone (EMS) mutagenic population ofrice cultivar 9311. The phenotypic characteristics ofwere analyzed by pigments determination and agronomic traits observation. Thegene was identified by map-based cloning method. The gene expression was analyzed by the quantitative real-time PCR.【Result】Themutant showed stripe leaf phenotype from two-leaf stage to heading and white panicle after heading accompanied by obviously decreased pigment contents compared with wild type. Themutant was also featured with delayed heading and decreased plant height and yield and so on. Genetic analysis demonstrated that the mutant phenotype was controlled by a recessive nuclear gene. Thegene was fine-mapped to a 0.91 Mb interval between markers C6-4 and N14 on the short arm of rice chromosome 6. Sequence comparison displayed that a single nucleotide substitution (G776A) in the coding region of ribonucleoside-diphosphate reductase small chain(RNRS1), which led to the amino acid change from Gly to Asp. Thewas allelic to,and. We analyzed the mutant sites and phenotypes of the four alleles and summarized the effect of mutation on plant phenotypes and the difference betweenand. In addition, expression analysis revealed that genes involved in chlorophyll biosynthesis were differently regulated, genes involved in the first and second steps of chloroplast differentiation were up-regulated, and genes involved in photosynthesis were down-regulated. 【Conclusion】We analyzed the effect of mutant sites in() gene on rice phenotypes. It deepens understanding forfunction and help to elucidate the molecular mechanism of chloroplast development.

rice (); mutant;mutation analysis; expression analysis

Q343.5; Q754; S511.01

A

1001-7216(2018)04-0325-10

2017-09-28;

2018-01-14。

安徽省農業科學院科技創新團隊項目(18C0101)；安徽省農業科學院學科建設項目(17A0103)；國家863計劃資助項目(2014AA10A604-17)；國家重點研發計劃資助項目(2016YFD0100101-06; 2017YFD0100406)。

10.16819/j.1001-7216.2018.7122