水稻黑條矮縮病毒P7-1基因對水稻的遺傳轉化及轉基因植株的抗病性分析

袁平平 孫楓 倪海平 朱佳慧 周益軍 蔣選利 徐秋芳,*

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水稻黑條矮縮病毒基因對水稻的遺傳轉化及轉基因植株的抗病性分析

袁平平1, 2孫楓2倪海平2朱佳慧2周益軍2蔣選利1,*徐秋芳2,*

(1貴州大學農學院, 貴陽 550025;2江蘇省農業科學院 植物保護研究所, 南京 210014；*通訊聯系人, E-mail: xuqiufang@jaas.ac.cn; JXL3237@163.com)

【目的】通過在水稻中過量表達水稻黑條矮縮病毒(, RBSDV)基因，分析RBSDV是否是導致水稻不育的重要致病因子，并明確過量表達轉基因植株對病毒的抗性。【方法】采用RT-PCR方法從感病植物中擴增獲得RBSDV基因，構建pCAMBIA-1300-P7-1載體，通過農桿菌轉化法獲得轉基因水稻，觀察水稻是否能夠正常結實，并采用人工接種病毒方法分析轉基因植株的抗性。【結果】過量表達RBSDV的轉基因水稻生長、結實正常。在接種7 d和14 d時轉基因植株中病毒積累量顯著低于野生型對照，但在28 d時部分轉基因株系中病毒積累量高于對照，接種30 d時轉基因植株的發病率與對照無明顯差異。【結論】在水稻中過量表達RBSDV不影響水稻的結實；轉基因水稻在RBSDV侵染早期可抑制病毒的積累，但在后期對病毒的抗性與對照沒有明顯差異。

水稻黑條矮縮病毒；過量表達；育性；抗性評價

水稻黑條矮縮病毒(, RBSDV)為呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟病毒屬()成員，主要通過介體灰飛虱以持久增殖方式傳播，可侵染水稻、小麥、玉米等禾本科植物[1]。水稻感染該病毒后表現為植株矮縮，葉色濃綠，不抽穗或穗小，葉脈和莖稈上早期出現蠟白色、后期出現黑褐色的瘤狀突起[2]。20世紀60年代和90年代后期，水稻黑條矮縮病在我國暴發流行，部分地區病害發生率超過了90%[3]。2007年以來，該病害又在江蘇等地粳稻上普遍發生，2008年僅江蘇省發病面積達26.7萬hm2，2009年增加到33.3萬 hm2，且由于目前生產上推廣的品種絕大多數不抗水稻黑條矮縮病，對水稻生產造成巨大威脅[4]。

RBSDV病毒基因組由10條線性雙鏈RNA組成，根據其在聚丙烯酰胺凝膠上的遷移速率由快到慢的順序依次稱為S1~S10。S7全長2193 nt，編碼363個氨基酸，含有兩個不重疊的ORF，編碼兩個蛋白P7-1和P7-2，均為病毒的非結構蛋白[5]。在感病植物和介體昆蟲中均可檢測到P7-1蛋白的表達，但在不同寄主中的大小存在差異。在感病植物中P7-1蛋白的大小為41 kD，而在昆蟲中則為44 kD，暗示P7-1在不同的寄主中可能存在不同的修飾[6]。免疫膠體金標記顯示P7-1在管狀結構中大量存在，表明其為管狀結構的主要組成部分，在RBSDV侵染的細胞中，管狀結構常常不完全封閉，其中含有大量病毒顆粒[6]。P7-1的亞細胞定位分析表明，該蛋白在質壁分離的細胞中可定位于細胞核、細胞質、細胞周圍，并與胞間連絲的標記蛋白PDLP1存在共定位[7]。

植物感染RBSDV后表現矮化，不能正常抽穗結實。在非寄主植物擬南芥中過量表達RBSDV基因后花藥不能開裂，花藥中的木質素含量顯著下降，轉基因植株不能正常結實[8]。由于擬南芥不是RBSDV的寄主植物，為進一步研究RBSDV基因功能，明確其是否是導致寄主植物不育的致病因子，我們構建了pCAMBIA1300-P7-1的重組表達載體，轉化水稻日本晴，獲得了過量表達RBSDV P的轉基因植株，并分析了轉基因植株對病毒的抗性。

1 材料與方法

1.1 材料

用于擴增水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)基因的感病水稻采自江蘇省泰州市姜堰區，用于接種的灰飛虱由江蘇省農業科學院植物保護研究所病害室飼養保存。用于遺傳轉化的水稻品種為日本晴。

1.2 RBSDV P7-1基因的克隆

根據NCBI數據庫中RBSDV基因(登錄號：AF397894)序列設計擴增基因的PCR引物-I-F和-I-R(表1)，擴增產物的理論大小為1089 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

采用Trizol試劑(TaKaRa)提取感染RBSDV的水稻葉片總RNA，利用反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser, TaKaRa)合成cDNA。PCR體系如下：cDNA 1.0 μL，上下游引物各0.5 μL，10×緩沖液2.5 μL，dNTP 0.5 μL，酶0.5 μL，加ddH2O補足至25.0 μL。PCR條件如下：94℃下5 min；94℃下1 min，56℃下40 s，72℃下1 min，32個循環；72℃下延伸10 min。

的PCR擴增產物經DNA回收后連接至pMD18-T載體，采用菌落PCR篩選陽性克隆后，提取質粒，酶切鑒定插入片段大小。酶切正確的質粒進行測序，基于NCBI數據庫進行核酸序列比對，采用DNASTAR軟件分析氨基酸序列的同源性，獲取pMD18T-P7-1重組質粒。

表1 本研究所用引物

1.3 重組表達載體pCAMBIA-1300-P7-1的構建

用限制性內切酶I和I酶切pMD18T- P7-1重組質粒，酶切所得基因片段回收后用T4連接酶定向連接至pCAMBIA-1300表達載體。采用擴增基因引物進行PCR，篩選陽性克隆，采用I和I酶切陽性克隆質粒，獲得pCAMBIA-1300-P7-1重組表達載體。

1.4 農桿菌介導的遺傳轉化及轉基因水稻的檢測

1.4.1 農桿菌介導的遺傳轉化

挑選成熟、飽滿的水稻種子，去穎殼后進行水稻愈傷組織的誘導和繼代培養，將pCAMBIA- 1300-P7-1質粒采用電擊法導入GV3101農桿菌，挑選愈傷組織后進行農桿菌轉化，在篩選培養基上篩選后，進行分化、生根培養，獲得T0轉基因植株。

1.4.2 轉基因水稻鑒定

采用CTAB法提取T0代轉基因植株葉片總DNA。用擴增潮霉素磷酸轉移酶()基因的引物-F和-R進行PCR檢測。采用Trizol法提取轉基因植株葉片總RNA后，反轉錄獲得cDNA，用-F/-R(表1)和-I-F/-I-R引物分別檢測和基因的表達。

T0陽性轉基因植株收種后，采用CTAB法提取T1轉基因植株葉片DNA，采用引物進行PCR檢測，收取分離比接近3∶1的T1轉基因植株的種子，檢測對應T2株系分離情況，T2株系不發生分離的認為是純合轉基因株系。

1.5 RBSDV P7-1基因表達分析

提取培養20 d的T2代轉基因植株葉片總RNA，反轉錄獲得cDNA，采用擴增的引物(-I-F/-I-R)進行PCR擴增，分析轉基因植株中基因是否表達。此外，采用熒光定量PCR(qRT-PCR)分析基因的相對表達量。基因的擴增引物為-F1和-R1，的擴增引物為-F和-R(表1)。qRT-PCR參照Xu等[10]的方法進行。

1.6 轉基因植株對RBSDV的抗性分析

挑選4個T2代純合轉基因株系(#-14，#-19，#-40，#-46)，采用人工接種方法接種RBSDV，以野生型日本晴作為對照。人工接種RBSDV參照周彤等[9]的方法進行，略有修改。將1~2齡無毒灰飛虱若蟲在感染RBSDV的水稻病株上飼喂7 d后，轉接至武育粳3號水稻幼苗上，飼養7 d使其度過循回期，采用ELISA方法檢測灰飛虱的帶毒率，將攜帶RBSDV的灰飛虱按2或3頭/株的蟲量接種于3葉期野生型日本晴和T2代轉基因水稻上，每株苗接種3頭有效蟲；同時接種不攜帶RBSDV的無毒灰飛虱作為對照。接種2~3 d后將水稻苗移栽至大田，接種30 d后統計發病率。

人工接種RBSDV 7 d、14 d、21 d、28 d時，將每個品系的水稻葉片進行混合取樣，提取總RNA，反轉錄合成cDNA。采用qRT-PCR分析轉基因植株和對照植株中編碼病毒外殼蛋白的基因表達情況，以水稻為內參基因。RBSDV引物為RBSDV-F和RBSDV-R。qRT-PCR參照Xu等[10]的方法進行。

A－PCR擴增RBSDV P7-1基因(M－DNA標記，泳道1和2分別為以健康和感病植株cDNA擴增P7-1的PCR產物)；B－PCR篩選pMD18T-P7-1陽性克隆；C和D－pMD18-T-P7-1和pCAMBIA-1300-P7-1質粒的酶切分析(泳道5和7為重組質粒酶切產物，泳道6和8為未酶切的質粒對照)。

Fig. 1. Construction of the pCAMBIA-1300-P7-1 expression vector.

2 結果與分析

2.1 水稻黑條矮縮病毒P7-1基因克隆及序列分析

以感染RBSDV的水稻cDNA為模板，采用-I-F/-IR為引物，PCR擴增基因。瓊脂糖凝膠電泳分析表明，PCR擴增獲得一條約1.1kb的條帶，與目的基因理論大小1089 bp相符(圖1-A)。PCR產物回收后連接pMD18-T載體，轉化大腸桿菌后采用PCR篩選獲得陽性克隆(圖1-B)。陽性克隆質粒用I和I進行雙酶切，可獲得一條與目的基因大小一致的條帶(圖1-C)，表明基因已連入pMD18-T載體。pMD18T-P7-1測序結果表明，克隆所得基因ORF長為1089 bp，編碼363個氨基酸。在NCBI網站進行比對分析，發現測序所得序列與RBSDVCDS核酸序列(登錄號：AF397894)有2個堿基的差異，同源性為99.8%，蛋白序列比對發現有1個位點的差異，同源性為99.7%，表明擴增所得基因為RBSDV基因。

2.2 重組表達載體pCAMBIA-1300-P7-1的構建

采用限制性內切酶I和I酶切pMD18T-P7-1質粒，獲得基因片段，回收后定向連接至經相同酶酶切的pCAMBIA-1300植物雙元表達載體，獲得重組表達載體pCAMBIA- 1300-P7-1。重組載體用I/I進行酶切鑒定，結果顯示pCAMBIA-1300-P7-1雙酶切后可獲得與理論大小一致的條帶(圖1-D)，表明成功構建獲得重組表達載體pCAMBIA-1300-P7-1。

2.3 農桿菌介導的遺傳轉化和分子檢測

采用農桿菌介導法將pCAMBIA-1300-P7-1轉化至水稻日本晴。經愈傷誘導、共培養、篩選、分化和生根等步驟，在含有潮霉素的培養基上篩選獲得52株具有抗性的T0代轉基因植株。為明確所得T0轉基因植株是否為陽性轉基因植株，提取T0轉基因植株葉片DNA后，PCR擴增基因，結果顯示PCR可擴增獲得大小約1 kb的條帶(圖2)，與目的片段大小(1009 bp)一致，表明所檢測T0植株為轉基因陽性植株。

提取T0轉基因植株葉片總RNA后，進行RT-PCR，分析和RBSDV基因的表達情況。結果顯示，T0轉基因植株中可擴增獲得與和基因大小相符的條帶(圖3)，表明RBSDV基因在轉基因植株中表達。

2.4 轉基因水稻中RBSDV P7-1基因的表達分析

為明確T2轉基因植株中基因的表達情況，采用RT-PCR和qRT-PCR分析了4個T2純合轉基因株系(#-14，#-19，#-40，#-46)中的表達情況。PCR結果表明，在4個株系中均有表達(圖4)。qRT-PCR結果分析顯示，在4個轉基因株系中RBSDV的相對表達量分別為基因的0.32、26.3、38.17和17.55倍(圖5)。

M－DNA標記；1~52：轉基因植株。

M, DNA marker, Lanes 1 to 52, Transgenic rice lines.

圖2 T0轉基因植株的PCR檢測

Fig. 2. PCR identification of T0transgenic plants.

A－RBSDV P7-1基因擴增; B－HPT基因擴增。M－DNA標記；1~52：轉基因植株。

Fig. 3. Expression analysis ofandgene in T0transgenic plants by RT-PCR.

M, DNA標記; #-14, #-19, #-40和#-46, T2轉基因株系。下同。

Fig. 4. Detection ofgenes in T2plants by RT-PCR.

柱上標不同小寫字母代表差異達0.05顯著水平。

Fig. 5. Expression ofgene in T2transgenic plants by qRT-PCR.

2.5 轉基因水稻對RBSDV的抗性分析

RBSDV轉基因植株的生長狀態和結實情況與對照相似，均可正常結實(圖6)，表明基因過量表達不影響水稻的結實。為分析過量表達轉基因水稻對RBSDV是否具有抗性，轉基因植株接種RBSDV后，采用qRT-PCR分析了過量表達對病毒積累量的影響。在接種病毒7 d和14 d時，轉基因植株中病毒的積累量顯著低于野生型對照，接種7 d時，#-14、#-19、#-40和#-46中基因的表達量分別為對照的11.5%、5.7%、6.2%和21.3%。在接種21 d時，4個轉基因株系中有2個株系的病毒積累量低于對照，但至接種28 d時，#-19和#-46轉基因植株中病毒的積累量與對照無顯著性差異，#-14和#-40植株中病毒積累量甚至顯著高于對照(圖7)。以上結果表明，轉基因植株僅在病毒侵染早期對病毒具有一定的抗性。

RBSDV接種轉基因植株30 d后，統計發病率。每株接種3頭帶毒蟲，4個轉基因株系及對照的發病率分別為81.1%、86.7%、84.6%、80.0%和87.5%。每株接種2頭帶毒蟲，4個轉基因株系及對照的發病率分別為70.6%、75.0%、92.0%、72.2%和80.0%，表明過量表達基因后轉基因植株對RBSDV不具有抗性。

3 討論

由RBSDV侵染引起的水稻黑條矮縮病和玉米粗縮病自20世紀60年代發生流行至今，已有50多年的歷史。近年來，隨著分子生物學等技術的發展，在RBSDV病毒基因功能、病毒與植物互作及病毒致病機制等方面均取得了較大進展[10-13]。RBSDV侵染寄主植物后的轉錄組和miRNA測序、蛋白質組分析等結果表明細胞壁合成相關基因、激素途徑等可能調控了植株矮縮、不育等癥狀[14-15]，但病毒侵染導致植物矮縮并影響結實的機制還有待深入研究。已有研究表明RBSDV P7-1蛋白在擬南芥中過量表達后，花藥不能開裂進而導致轉基因植株不能結實，P7-1很有可能是病毒侵染后導致植株不育的重要因子[8]。為分析P7-1蛋白在病毒致病過程中的作用，我們在水稻中過量表達了基因，然而，轉基因水稻并未表現不能結實的癥狀，其后代植株也能正常結實(圖6)。因此，P7-1是否是病毒侵染后導致植物不育的致病因子還需進一步研究。

通過表達病毒基因獲得抗病轉基因植物是抗病毒基因工程的主要策略之一。自1986年在煙草中過量表達煙草花葉病毒(TMV)外殼蛋白基因獲得能穩定遺傳的抗病毒轉基因煙草以來[16]，利用病毒蛋白基因如外殼蛋白、病毒復制酶基因和運動蛋白等介導植物對病毒產生抗性有許多成功例子[17-18]。為明確本研究獲得的過量表達RBSDV轉基因植株是否具有對病毒的抗性，我們采用人工接種RBSDV的方法分析了轉基因植株對病毒的抗性。結果顯示，接種病毒7 d和14 d時，轉基因植株中病毒積累量顯著低于對照，但至接種28 d時轉基因植株中的病毒積累量沒有下降，且接種30 d時轉基因植株發病率與對照沒有顯著差異，表明過量表達的轉基因植株不具有對RBSDV抗性。有研究報道，在水稻中過量表達水稻矮縮病毒(RDV)的非結構蛋白Pns11的轉基因植株不表現對RDV的抗性[19]。這表明在植物中表達病毒的非結構蛋白基因不一定能產生對病毒的抗性。

病毒運動蛋白基因可介導植物對病毒抗性。將番茄斑駁病毒(TMoV)或煙草花葉病毒(TMV)缺失突變后的運動蛋白導入煙草后，轉基因煙草可以抑制TMoV或TMV病毒侵染[20-22]。將菜豆矮化花葉病毒(BDMV)野生型或突變的運動蛋白BV1或BC1基因導入到番茄后轉基因番茄能推遲ToMV的感染[23]。RBSDV P7-1可在細胞內形成管狀結構[7,24]，在植物中P7-1可定位于胞間連絲處[7]。轉基因植株在接種病毒7 d和14 d時，病毒積累量顯著低于對照，推測過量表達后在胞間連絲處通過影響病毒細胞間運動減緩病毒侵染。

WT, 野生型; #-14, #-19, #-40和#-46, T2轉基因株系。下同。

Fig. 6. Seed setting of the T2transgenic plants with overexpression of RBSDV.

*代表與野生型相比差異達0.05顯著水平。

Fig. 7. Relative expression of RBSDVin transgenic plants as infected by virus for various time.

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Genetic Transformation ofGene in Rice and Its Virus Resistance Analysis

YUAN Pingping1, 2, SUN Feng2, NI Haiping2, ZHU Jiahui2, ZHOU Yijun2, JIANG Xuanli1,*, XU Qiufang2,*

(1College of Agriculture, Guizhou University, Guiyang 550025, China;2Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;*Corresponding author, E-mail: xuqiufang@jaas.ac.cn; JXL3237@163.com)

【Objective】The purpose of this study is to determine whether(RBSDV)is an important pathogenic factor related to infertility in rice and to analyze the resistance of thetransgenic rice to RBSDV by overexpression ofin rice. 【Method】RBSDVgene was amplified from virus-infected plants by RT-PCR. The recombination plasmid pCAMBIA-1300-P7-1 was constructed and transformed to rice bytransformation. The fertility of transgenic plants was evaluated and the resistance of the transgenic rice plants to RBSDV was identified by artificial inoculation of virus. 【Result】The transgenic plants showed normal growth and fertility. The virus accumulation in the transgenic plants was significantly lower than the wild type at 7 days and 14 days after inoculation, but it was higher in some transgenic lines than the control at 28 days after inoculation. There were no significant differences in disease incidence between the transgenic plants and the wild type at 30 days after inoculation. 【Conclusion】 Overexpressing RBSDVin rice does not affect the fertility. Transgenic rice had lower accumulation of virus in the early stage after RBSDV infection, but did not exhibit resistance to the virus at the later stage.

; overexpression; fertility; resistance evaluation

S435.111.4+9; S511.034

A

1001-7216(2018)04-0342-07

2018-01-05;

2018-05-08。

國家重點研發計劃資助項目(2016YFD0300706)；國家自然科學基金資助項目(31471768)。

10.16819/j.1001-7216.2018.8014