腹膜間皮細胞轉分化小鼠模型差異表達長鏈非編碼RNA的篩選及意義

王玉潯，安雅臣，蔣艷茹

(1華北理工大學附屬醫院，河北唐山063000；2唐山市中醫醫院)

腹膜透析是終末期腎臟疾病患者行腎臟替代治療的主要方式之一。腹膜結構、功能的正常是保證腹膜透析有效性的關鍵因素。腹膜間皮細胞是腹膜組織的主要組成細胞。研究表明，長期暴露在高糖腹膜透析液中，腹膜間皮細胞發生轉分化，導致腹膜纖維化，最終使腹膜功能喪失[1～3]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)可通過基因調控參與多種疾病的發生發展過程。2016年10～11月，本研究分析了lncRNA與腹膜間皮細胞轉分化的關系，旨在為進一步闡明腹膜間皮細胞轉分化的分子生物學機制提供理論依據。

1 材料

SPF級C57BL/6雄性小鼠20只，7～8周齡，體質量(25±3)g，由北京實驗動物有限責任公司提供。兔抗鼠轉化生長因子β1(TGF-β1)、E鈣黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)一抗 ，均購自Epitomics公司(USA)。

2 方法與結果

2.2 動物分組及處理 小鼠均給予適應性喂養7天，隨機分為對照組和模型組，每組10只。對照組正常飼養4周；模型組給予4.5%高糖腹膜透析液腹腔注射，每次注射劑量為1 mL/kg，1次/d，連續4周。

2.3 腹膜組織形態學觀察 模型組透析4周結束時處死兩組小鼠，取壁層腹膜組織，進行HE染色，觀察腹膜間皮細胞及其周圍結締組織形態學改變。結果顯示，對照組腹膜組織呈一層致密、光滑的薄層，覆蓋一層扁平狀間皮細胞，細胞連接良好，間皮下基底膜薄，與結締組織相連，無膠原纖維組織沉積，未見毛細血管擴張、充血及炎性細胞浸潤；模型組腹膜組織薄厚不均，部分間皮細胞腫脹變形甚至脫落，纖維裸露，炎性細胞增多，膠原沉積增多，間皮下致密層增厚。提示腹膜間皮細胞發生轉分化。

2.4 腹膜間皮細胞轉分化蛋白TGF-β1、E-cadherin、α-SMA表達檢測 采用Western blotting法。取2.3制備的兩組小鼠臟層腹膜組織，利用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。取約150 μg加樣緩沖液100 ℃沸水煮沸5 min，充分變性后進行SDS-PAGE電泳，轉膜(240 Ma，120 min)，5%脫脂牛奶常溫下封閉1 h；分別加入TGF-β1(1∶3 000)、E-cadherin(1∶500)、α-SMA(1∶300)一抗，4 ℃搖床過夜；洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗常溫孵育2 h；再次洗膜，用ECL發光液在暗室進行壓片、顯影、曝光。以GAPDH為內參照，采用圖像分析系統掃描確定膠片上雜交條帶的相對吸光度(A)值，進行相對定量分析。結果顯示，與對照組比較，模型組腹膜間皮細胞TGF-β1、α-SMA表達升高，E-cadherin蛋白表達下降，見表1；提示轉分化模型建立成功。

表1 兩組腹膜間皮細胞TGF-β1、E-cadherin、α-SMA蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.5 差異表達lncRNA篩選 采用芯片技術。取2.3獲得的兩組小鼠臟層腹膜組織(每組3只)，TRIzol法提取組織總RNA，用Invitrogen SuperScript ds-cDNA synthesis kit合成雙鏈cDNA，進行熒光標記并雜交漂洗，用Agilent芯片掃描儀(G2565CA)進行掃描，使用Agilent Feature Extraction(v10.7)軟件對雜交圖片進行分析并提取數據。使用Agilent Gene Spring軟件對數據進行歸一化和差異分析。差異篩選標準： fold>1.5 &P<0.05。上述工作均由北京博奧生物有限公司完成。根據芯片表達數據結果，將對照組與模型組的lncRNA表達譜進行比較，兩組表達量比值在2倍以上且有統計學意義的lncRNA共757條，2倍以上上調的共311條，2倍以上下調的共446條。同時，基因芯片也檢測了在腹膜細胞轉分化過程中mRNA的表達譜，差異表達量比值在2倍以上且有統計學意義的mRNA共1 431條，2倍以上上調的共489條，2倍以上下調的共942條。兩組表達量差異最大的前20個lncRNA見表1，表達量差異最大的前20個mRNA見表2。

表1 兩組表達量差異最大的前20個lncRNA

表2 兩組表達量差異最大的前20個mRNA

2.6 差異表達mRNA的GO功能注釋分析 根據Gene Ontology數據庫將差異表達mRNA按分子生物學功能、生物學過程和在細胞組件中的作用三個方面進行功能富集，發現在腹膜間皮細胞轉分化中，差異表達的靶基因mRNA主要參與細胞膜的固有組成、細胞周邊組織結構組成、炎癥防御反應等。篩選出的前4位GO功能注釋名稱及其基因數見表3。

表3 差異表達lncRNA的GO功能注釋

2.7 KEGG通路分析 利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)數據庫對差異表達mRNA進行信號通路分析，觀察在腹膜纖維化過程中發生顯著變化的mRNA可能與哪些信號通路的改變有關，結果表明差異表達mRNA可能參與了真核生物翻譯過程、膜蛋白合成等途徑。篩選出的前4位生物學通路名稱及其基因數見表4。

2.8 差異lncRNA mRNA表達檢測 采用RT-PCR法對差異表達lncRNA進行驗證。選擇差異表達倍數較大(>5倍)，長度為500～2 000 nt，表達豐度在1 000以上的2個上調的和2個下調的lncRNA即ri|4732442J12|PX00051O23|2580、NONMMUT055611、NONMMUT002253、NONMMUT064302進行RT-PCR驗證。采用ABI7500PCR儀以SYBR Green熒光染料摻入法相對定量，同時以GAPDH為內參照，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的差異表達倍數。

表4 差異表達mRNA的KEGG通路及基因數

結果顯示，模型組NONMMUT002253、NONMMUT064302相對表達量低于對照組，ri|4732442J12|PX00051O23|2580、NONMMUT055611相對表達量高于對照組(P均<0.01)。結果與芯片檢測結果基本一致，表明芯片結果的可靠性。見表5。

表5 兩組差異表達lncRNA mRNA相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.01。

3 討論

上皮-間質轉化(EMT)是指上皮來源的細胞在特定的生理和病理條件下向間質性細胞發生轉化的一種現象[4,5]。研究表明，EMT的過程包括細胞形態學和基因型改變，細胞黏附分子(如E-鈣黏蛋白)表達減少，使立方上皮細胞下調或失去細胞間相互作用；上皮細胞外形演變為梭形纖維細胞形態，細胞角蛋白結構發生改變；獲得了某些間質細胞或纖維原細胞的特性，如α-SMA、Vimtin蛋白、骨橋蛋白、Snail、slug及其他間質特性蛋白表達上調等[6～9]。

腹膜間皮細胞是腹膜的主要組成細胞，是維持腹膜結構完整、功能穩定和保證腹膜透析有效性的重要因素。腹膜間皮細胞發生EMT被認為是腹膜纖維化的始動環節[10,11]，其發生的初期是一個可逆的過程。早期干預腹膜間皮細胞轉分化、防止腹膜纖維化及保護腹膜透析患者的腹膜功能是目前研究的重點。lncRNA是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA分子，隨著全基因組分析技術的快速發展及廣泛應用，研究人員發現lncRNA可作為人類基因組中一類重要的表觀遺傳調控因子，以RNA形式通過表觀遺傳調控、轉錄及轉錄后調控等多層面調控DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質重構，最終調節靶基因的表達及翻譯[12～16]，廣泛參與細胞分化、增殖和代謝，參與多種疾病的發生及發展[17～19]。目前關于lncRNA與EMT的關系及其在腫瘤領域的重要性備受關注。研究發現，lncRNA的調控作用具有組織特異性，在不同腫瘤調控中發揮不同的作用。lncRNA可通過調控 EMT過程對細胞間連接和黏附進行調節，通過抑制EMT或促進間質-上皮轉分化(MET)過程抑制或促進腫瘤發生[20～23]。

本研究借助芯片技術篩選出了與腹膜間皮細胞轉分化相關的lncRNA及其下游靶基因mRNA的差異表達譜，并利用RT-PCR技術，對表達差異最為顯著的4個lncRNA進行驗證，其結果與芯片技術結果相一致，證明芯片結果的可靠性。

本研究首次在轉錄組學層面提出了lncRNA參與了腹膜透析相關性腹膜纖維化的病理生理過程。通過高通量微陣列芯片技術證實lncRNA參與了腹膜間皮細胞轉分化，從而導致腹膜纖維化的發生與發展。在后續的研究中，我們將進一步分析驗證差異表達lncRNA的分子生物功能及其靶基因，進一步闡明lncRNA在腹膜間皮細胞轉分化中的作用，從而為臨床防治腹膜透析相關性腹膜纖維化提供理論依據。