胃癌組織中絲氨酸蛋白酶1的表達及意義

吳紅學，童仕倫，柯東，鄒力

(武漢大學人民醫院，武漢 430060)

根據國際癌癥研究機構的統計數據，胃癌發病率位于惡性腫瘤第5位、病死率居第3位[1]。中國是胃癌的高發地區之一，發病例數和死亡例數分別占全球胃癌發病和死亡的42.6%和45.0%[2]。隨著中國人民生活水平的提高，生活方式和飲食結構的改變，胃癌的發病率仍呈上升趨勢[3]。胃癌的治療近年來雖取得一定進展，但以手術為主，放化療為輔的治療模式，效果仍不滿意。胃癌發生發展的機理目前尚未完全明確，普遍認為其形成、發展是一個涉及多個基因、歷經多個階段的過程。目前大量研究已證明，絲氨酸蛋白酶1(HTRA1)基因在子宮內膜癌[4]、肝癌[5]、卵巢癌[6]、膠質細胞瘤[7]等多種癌癥中表達下調甚至缺失，表明HTRA1具有腫瘤抑制功能，但其在胃癌中是否亦有腫瘤抑制功能尚無報道。本研究收集武漢大學人民醫院2010年1月～2011年12月有完整臨床病理資料及隨訪記錄的胃癌切除術患者石蠟包埋標本108例份，行免疫組化檢測。另收集2017年6～12月行胃癌切除的手術標本32例份，行RT-PCR檢測，觀察HTRA1在胃癌中的表達情況，并分析其與患者臨床病理特征及預后的關系，從而探討HTRA1在胃癌中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集武漢大學人民醫院2010年1月～2011年12月有完整臨床病理資料及隨訪記錄的胃癌切除術患者石蠟包埋標本108例份，患者男63例、女45例，年齡28～84歲，平均63.6歲。腫瘤直徑<5 cm 50例，≥5 cm 58例；低或未分化57例，中高分化51例；浸潤深度T1～233例，T3～475例；胃周淋巴結有轉移88例，無轉移20例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期42例，Ⅲ～Ⅳ期66例。患者術前均未接受過放療或化療。無其他惡性腫瘤病史。此組標本用于免疫組化檢測。另收集2017年6～12月行胃癌手術切除的新鮮組織標本32例份，每個病例均取胃癌組織及遠癌組織，遠癌組織指距腫瘤5 cm以外的正常胃組織。標本切下后迅速置于-196 ℃液氮中冷凍，然后置于-80 ℃冰箱保存。此組標本用于RT-PCR檢測。本研究得到武漢大學人民醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 胃癌及遠癌組織中HTRA1蛋白表達檢測 采用免疫組化法。分別對胃癌組織及遠癌組織進行免疫組化S-P法染色，石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，H2O2室溫孵育20 min滅活內原性過氧化物酶，切片抗原修復后，滴加鼠抗人HTRA1一抗(1∶200稀釋)50 μL，4 ℃過夜；過夜后將切片室溫平衡1 h，加入抗鼠IgG二抗，37 ℃ 1 h；DAB顯色，蘇木精復染，脫水、透明、封片、鏡檢。所有免疫組化結果由兩位病理科醫生獨立讀片判斷，顯微鏡下觀察結果。結果采用半定量計分方法，在200倍高倍鏡下，隨機選擇5個腫瘤區域，無陽性細胞計0分，陽性細胞占1%～10%計1分，11%～50%計2分，51%～80%計3分，81%～l00%計4分；同時評估陽性細胞染色強弱：0分為無色；1分為淺黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。兩項的乘積即為該例病變的免疫組化評分：0分為陰性(-)；1～4分為弱陽性(+)；5～8分為中度陽性(++)；9～12分為強陽性(+++)。以大于5分判斷為陽性，5分以下為陰性。

1.3 胃癌組織中HTRA1 mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。TRIzol法提取組織中的總RNA，作為反轉錄模板生存cDNA。HTRA1引物：正向引物5′-TTGTTTCGCAAGCTTCCGTT-3′，反向引物5′-ACGTGGGCATTTGTCACGAT-3′。β-actin作為內參，正向引物5′-CACGGCACTGATTTTCAGTTCT-3′，反向引物5′-TTCTTGCTGCCAGTCTGGACT-3′。反應條件：變性階段(94 ℃ 5 min)和35個循環的擴增定量階段(94 ℃ 15 s；58 ℃ 45 s)。2ΔΔCT法計算每個腫瘤樣本對于正常對照樣本目的基因的相對Ct值差異。Ct表示目的基因的熒光值設定的閾值時反應循環數。ΔΔCt=ΔCt(腫瘤樣本)-ΔCt(對照樣本)。

1.4 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件。應用配對t檢驗評估胃癌組織與遠癌組織中HTRA1蛋白及mRNA表達差異，應用χ2檢驗評估HTRA1相對表達與臨床病理特征的關系， Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并應用Log-Rank檢驗評估HTRA1 mRNA表達與生存時間的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HTRA1蛋白表達比較 THRA1蛋白陽性呈棕褐色顆粒，主要表達于細胞核中，HTRA1蛋白在胃癌組織中陽性表達率為17.6%(19/108)，而在遠癌組織中陽性表達率為82.4%(89/108)，與遠癌組織相比，胃癌組織中的HTRA1蛋白表達下調(P<0.01)。

2.2 胃癌及遠癌組織中HTRA1 mRNA表達比較 胃癌標本中HTRA1 mRNA表達較遠癌組織下調24例(75%)，胃癌及遠癌組織中HTRA1 mRNA相對表達量分別為6.06±1.57、4.85±1.39，胃癌與遠癌組織相比有統計學差異(P=0.002)。

2.3 THRA1蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征的關系 HTRA1蛋白表達與腫瘤大小、浸潤深度有關(P均<0.05)，HTRA1蛋白表達與腫瘤相關淋巴結轉移、組織分化程度、患者年齡及性別等無關(P均>0.05)，見表1。

表1 HTRA1蛋白表達與108例胃癌患者臨床病理特征的關系[例(%)]

2.4 HTRA1蛋白表達與胃癌患者預后的關系 本組患者隨訪過程中有67例死亡，中位生存時間為46.8個月。其中HTRA1蛋白表達陽性與陰性患者的3年生存率分別為68.4%和50.6%，差異有統計學意義(P<0.01)。Kaplan-Meier繪制生存曲線結果顯示，HTRA1蛋白低表達者較高表達者生存時間縮短(P=0.012)，見圖1。

圖1 HTRA1蛋白陽性與陰性表達者生存曲線

3 討論

絲氨酸蛋白酶家族(HTRA)是一種具有熱休克蛋白性質的膜蛋白酶,廣泛存在于人體的組織器官中。截止到目前，人類共發現四種HTRA家族同源物，即HTRA1 (Prss11, L56)、HTRA2 (Omi)、HTRA3 (PRSP)和HTRA4[8]。這些同源物均包含1個高度保守的胰酶樣蛋白酶結構域和1個1～2碳末端盤狀同源區域[9]。盤狀同源區域是蛋白質-蛋白質反應模塊，作為多聚體信號復合物的組織者發揮重要作用[10]。被認為是激活細菌和人類HtrA家族成員蛋白酶活性的開關[11]。

HTRA1是第一個被發現的人絲氨酸蛋白酶家族成員，最初是在肉毒病毒40(SV40)成纖維細胞中檢測到[11]，之后在軟骨關節炎病例中亦檢測到[12]。在哺乳動物的多種生物機制中發揮重要作用，在骨關節炎、阿爾茨海默病、黃斑變性、細胞遷移、腫瘤侵襲和轉移及化療引起的細胞毒性中起重要作用[13]。HTRA1基因包含9個外顯子，編碼458個氨基酸，定位于染色體10q26.2。從氨基酸的氮末端到碳末端包含有信號肽(SS)、胰島素生長因子結合域(IGFBP)、Kazal型蛋白酶抑制劑結構域、胰酶樣蛋白酶結構域及盤狀同源區域等[10]。研究表明HTRA1在宮頸癌、黑色素瘤、子宮內膜癌及肝癌等多種癌癥中表達下調甚至缺失，這表明HTRA1具有腫瘤抑制功能。Chien等[14]研究發現，HTRA1表達敲除后能使宮頸癌細胞SKOV3獲得懸浮生長特性，而過表達HTRA1則能誘導另一種宮頸癌細胞OV2O2死亡。HE等進一步研究發現，SKOV3和TOV21G宮頸癌細胞株中HTRA1表達敲除后，腫瘤轉移的關鍵性屏障失巢凋亡被抑制。推測失巢凋亡被抑制可能與EGFR/AKT信號通路激活有關，由此其研究小組采用免疫沉淀和免疫熒光法檢測了細胞膜和細胞核內HTRA1和EGFR相互作用情況，發現在懸浮培養基SKOV3 細胞中，HTRA1表達自動上調，而HTRA1表達上升能抑制EGFR/AKT信號通路，導致細胞死亡增加。而采用蛋白酶水解能力喪失突變型HTRA1轉染SKOV3 細胞后，則不能檢測到EGFR/AKT信號通路被抑制或細胞死亡率升高。因此推測HTRA1主要通過抑制EGFR/AKT信號通路使其具有抑制腫瘤轉移能力[15]。

本研究通過免疫組化和RT-PCR實驗方法，分別在蛋白和基因層面證實胃癌組織中HTRA1表達低于遠癌組織，差異有統計學意義，與其在宮頸癌、肝癌等中的研究基本一致。結合臨床病理特征分析發現，HTRA1表達與腫瘤大小、浸潤深度有關，HTRA1低表達的患者，腫瘤生長更大，浸潤更深。并在生存分析中發現，HTRA1基因低表達患者預后差。提示HTRA1是一種抑制胃癌生長的基因。但其在胃癌中如何發揮抑制腫瘤的發生、生長、轉移尚需進一步研究。