實時熒光定量PCR檢測妊娠晚期孕婦B族鏈球菌感染的臨床價值

雷萍，石艷艷，羅紅權，吳雨露，李寧，張麗萍

(四川省婦幼保健院檢驗科，成都 610045)

B族鏈球菌(GBS)為革蘭陽性兼性厭氧球菌，主要寄生在人體下消化道及泌尿生殖道。GBS為條件致病菌，孕產婦和新生兒感染的主要細菌之一，亦可導致具有基礎疾病及免疫力低下人群的機會性感染[1]。孕婦GBS感染可引起胎膜早破、流產、早產、絨膜羊膜炎、宮內感染、胎兒生長受限、孕產婦敗血癥和產后子宮內膜炎等，可通過垂直傳播引起新生兒肺炎、敗血癥、腦膜炎等[2-3]。但國內對于孕婦GBS感染尚無統一且規范的干預指南，且有研究認為孕婦GBS感染不會影響妊娠結局。我科根據多年的婦科經驗顯示，孕婦GBS篩查及早期干預對母兒具有重要意義。

目前篩查GBS的常用方法有細菌培養、特異性抗原或抗體測定、核酸探針檢測和實時熒光定量PCR等。細菌培養法是診斷GBS感染的金標準，但耗時長，且孕婦生殖道中存有多種細菌，在普通培養基中GBS生長受到抑制，易造成漏診；GBS抗原或抗體檢測可短時間內獲得結果，但假陰性率和假陽性率高；PCR檢測時間短、靈敏度高。快速獲得準確GBS結果，對孕期未進行GBS篩查而在臨產時來院分娩的孕婦尤其重要。本實驗評價了實時熒光定量PCR檢測孕婦GBS感染的臨床效能，分析了孕婦GBS感染對妊娠結局的影響。

材料與方法

一、研究對象

選擇2015年1月至2016年12月在本院孕婦保健并住院初次分娩的單胎孕婦共3 565例，孕35～37周，年齡23～39歲。根據孕婦意愿，將帶GBS的孕婦分為2個組，愿意接受干預治療的設為干預治療組，按CDC“圍生期GBS預防指南(2010)”[4]，實行產時抗生素預防和治療，對用藥有顧忌不愿接受干預治療的設為未干預治療組。

排除標準：非陰道分娩；取材前1月內患感染性疾病，全身或陰道局部使用過抗菌素。

本課題經院倫理委員會同意，所有受試孕婦或家屬均簽署知情同意書。

二、主要儀器與試劑

LightCycler2.0實時熒光定量PCR儀(羅氏，德國)，VITEK2 Compact微生物鑒定系統(梅里埃，法國)；GBS-DNA提取試劑和擴增試劑盒(北京博爾誠科技)；CAMP蛋白的基因設計特異引物、熒光探針、核酸制備及擴增檢測試劑盒(福建泰普生物)；BACT9120全自動血培養系統(BD，美國)；菌種鑒定采用API鑒定系統(中國生物梅里埃)。

三、方法

1.標本采集：擦去外陰分泌物后，將1根無菌拭子插入陰道下1/3，旋轉1周采取陰道分泌物，同時采集2根拭子，2根拭子置于1個無菌套管內作為1份標本，密閉；將1根無菌拭子插入肛門，于肛門括約肌上2～3 cm處輕旋轉，采取直腸分泌物，同時采集2根拭子，2根拭子置于1個無菌套管內作為1份標本，密閉。標本采集后1 h內送檢。經孕婦本人知情同意。

2.GBS培養：按《全國臨床檢驗操作規程》(第4版)。陰道和直腸拭子接種血瓊脂平皿，在5%～10%CO2環境下35℃孵育24～48 h。挑取血平皿上有β溶血的菌落進行CAMP試驗，并采用VITEK2 compact微生物鑒定系統進一步鑒定。

3.實時熒光定量PCR檢測GBS-DNA：對GBS編碼CAMP蛋白的基因設計特異引物和熒光探針。核酸制備、擴增檢測及陰陽性結果判斷嚴格試劑盒說明書。

4.GBS帶菌者判定[5]：直腸分泌物和陰道分泌物任一檢出GBS都確定為帶菌者。培養出GBS即判定為GBS帶菌者；GBS培養陰性而PCR陽性者，則再采集陰道和直腸分泌物做第2次GBS培養和DNA檢測，培養法和實時熒光定量PCR法任意一項陽性即判定為GBS帶菌者；第1次或第2次標本GBS培養和PCR均陰性判定為未攜帶GBS者。

直腸/陰道定植率=(直腸/陰道分泌物檢出GBS人數)/總人數100%。

5.新生兒細菌感染檢測：收集所有新生兒的血標本，采用BACT9120全自動血培養系統檢測，菌種鑒定采用API鑒定系統。

四、統計學處理

采用SPSS17.0 統計學軟件進行統計分析，率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、孕婦GBS攜帶率

3 565例孕婦確診為GBS攜帶者352例，帶菌率為9.87%。

二、不同年齡孕婦GBS攜帶率比較

隨著孕婦年齡增加，GBS帶菌率有增加趨勢，但不同年齡組間差異無統計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 各年齡段孕婦帶菌率[n(%)]

三、標本采集部位比較

352例GBS帶菌者中，陰道分泌物檢出率[40.63%(143/352)]低于直腸分泌物檢出率[86.93%(306/352)](P<0.05)；GBS在陰道的定植率[4.01%(143/3 565)]高于直腸[8.58%(306/3 565)](P<0.05)。

四、實時熒光定量PCR法與細菌培養法檢測孕婦GBS感染的比較

135例患者細菌培養和實時熒光定量PCR均陽性，3 191均為陰性，6例培養陽性而實時熒光定量PCR陰性，233例培養陰性而實時熒光定量PCR陽性(表2)。

表2 實時熒光定量PCR法與培養法檢測結果

五、實時熒光定量PCR法與細菌培養法檢測GBS的臨床效能

與細菌培養法比，實時熒光定量PCR法對第1次標本檢測結果診斷GBS感染的靈敏度(SEN)、特異性(SPE)、陽性預測值(+PV)、陰性預測值(-PV)、陽性似然比(+LR)和準確度均較高，陰性似然比(-LR)較低(表3)。

表3 實時熒光定量PCR法與培養法檢測GBS的臨床效能(%)

六、各組孕婦不良妊娠結局的比較

胎膜早破、早產、宮內感染、胎兒窘迫和新生兒感染的發生率，未干預治療組顯著高于GBS陰性組和干預治療組(P<0.05)，而干預治療組與GBS陰性組無統計學差異(P>0.05)(表4)。

表4 各組孕婦不良妊娠的發生率[n(%)]

注：與其他兩組比較，*P<0.05

七、各組新生兒感染病原檢查

各組均出現不同程度的GBS、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等感染，未干預治療組發生GBS感染數顯著增高(P<0.05)，而干預治療組與GBS陰性組無統計學差異(P>0.05)；其余菌種感染各組間均無統計學差異(P>0.05)(表5)。

表5 各組新生兒感染病原檢查[n(%)]

注：與GBS陰性組比較，*P<0.05

討 論

各種菌群共處于陰道微生態環境中并保持平衡狀態，即陰道微生態平衡。GBS為女性生殖道常見細菌，妊娠期體內雌激素和孕激素水平升高、糖原含量增加、陰道pH值改變及免疫功能低下，可能是引起陰道菌群失調，GBS繁殖增加[6]。本研究結果顯示，晚期孕婦陰道直腸GBS帶菌率為9.87%，低于歐美國家孕婦陰道直腸的帶菌率10%～35%[7]，與國內孕婦的帶菌率5%～15%[8]一致。流行病學調查顯示，歐美孕婦GBS帶菌率高于亞洲孕婦[9]。GBS的檢出率受多種因素影響，如人種、地域、年齡、檢測方法、取材部位和取材時間等[2，8]。本研究結果顯示，20～40歲孕婦的GBS帶菌率與年齡無關，與文獻[9-11]報道一致；直腸分泌物GBS檢出率顯著高于陰道分泌物，可見兩種標本聯合檢測可提高GBS的檢出率。

GBS對特殊人群如孕婦、新生兒有較強的致病性。妊娠期GBS感染的危害遠高于非妊娠人群。GBS通過產道上行擴散感染子宮和胎膜，使帶菌孕婦易發生晚期流產、早產、胎膜早破、絨毛羊膜炎和產褥感染等，其中早產和流產發生與GBS感染可引起磷脂酶A、前列腺素和炎癥因子等大量釋放有關[12]。妊娠期GBS感染可通過母嬰垂直或水平傳播至胎膜，通過炎性細胞的吞噬作用和蛋白水解酶的直接入侵，使胎膜局部張力減少，導致產前發生胎膜破裂、合并宮內感染，發生新生兒肺炎、腦膜炎和敗血癥等疾病[8，13]。本研究顯示，未干預治療的GBS帶菌孕婦人群的胎膜早破、早產、宮內感染、胎兒窘迫和新生兒感染的發生率顯著高于GBS陰性組和干預治療組，而干預治療組與GBS陰性組間無統計學差異，與文獻報道[9，14-15]一致，提示晚期孕婦GBS感染可危害孕婦和胎兒或新生兒的健康，在產程過程中對GBS感染孕婦給予抗菌素預防和治療可有效降低不良妊娠發生率。但也有文獻報道，GBS陽性組的胎膜早破、早產、胎兒宮內窘迫和新生兒感染的發生率與陰性組間并無顯著性差異[16]，這也是部分妊娠期GBS感染孕婦不接受治療的原因之一。本研究中三組孕婦均存在不同程度的新生兒GBS感染，未干預治療組發生GBS感染數明顯增高，而干預治療組與GBS陰性組的新生兒GBS感染數差異無統計學意義，提示GBS也可通過母嬰途徑傳染給新生兒，而給予藥物干預可有效抑制GBS自母親傳至新生兒。但3 213例GBS陰性組的仍有8例GBS感染的新生兒，提示GBS陰性組中至少有8例孕婦為GBS假陰性，可能與GBS感染具有潛伏性及間歇性的特點相關，但仍需要更多研究數據考察。

本研究顯示，實時熒光定量PCR法檢測孕婦GBS感染的靈敏度和特異性為98.30%和99.50%，與文獻報道[8，17]基本一致。細菌培養時間較長，一定程度影響了結果判斷，假陽性率較高，而實時熒光定量PCR檢測時間短，符合產前和產時的篩查要求；少數GBS感染孕婦細菌培養時缺乏溶血環而誤判為陰性，此時可以采用實時熒光定量PCR定性。

本研究中有6例細菌培養陽性而實時熒光定量PCR陰性，這可能是因為GBS為革蘭陽性菌，細胞壁有較厚的肽聚糖層，細菌難于裂解[18]，或細菌核酸樣品中有實時熒光定量PCR抑制劑；16例非GBS帶菌者實時熒光定量PCR陽性，這可能是因為標本間交叉污染。由此可見，對實時熒光定量PCR試驗，標本處理與核酸制備很重要。對于采用兩種方法均未檢出的GBS感染，可能與GBS感染具有潛伏性及間歇性有關。

綜上所述，實時熒光定量PCR是一種快速準確篩查妊娠晚期GBS的方法。妊娠晚期孕婦GBS感染會導致胎膜早破、早產、宮內感染、胎兒窘迫和新生兒感染的發生率升高，及時采取干預措施可有效降低不良妊娠結局的發生。