胚胎培養微滴內的溫度變化研究

徐士儒，姚志鴻，熊風，李觀貴，孫青，萬才云，陳培林，鐘惠嫻，曾勇

(深圳中山泌尿外科醫院生殖中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045)

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)中，胚胎培養環境是影響胚胎生長發育及IVF-ET結局的重要因素[1]。在體內，胚胎在母體子宮中發育，是一個恒溫恒濕的穩定生理環境[2]。但在體外，胚胎通常培養在培養皿微滴里，依靠CO2培養箱維持微滴一個類似子宮的穩定環境。然而，目前的胚胎培養方式，仍不可避免將胚胎移出培養箱行離箱觀察及操作。離開CO2培養箱的胚胎可能面臨溫度、pH值及滲透壓等變化所導致的應激反應，影響胚胎的發育潛能。我們主觀上盡量減少離箱操作時間，選擇快速恢復培養皿內微滴溫度等條件的胚胎培養箱。但仍無相關數據表明微滴在離箱操作過程中溫度的變化及操作時間是否合理及培養箱中微滴的復溫時間的長短。因此，本研究利用商品化溫度測定儀自組裝一套簡易的微滴溫度檢測裝置，對離箱操作條件下微滴溫度變化及放回不同類型CO2培養箱后微滴溫度恢復時間進行檢測，為胚胎實驗室臨床工作提供理論指導。

材料與方法

一、研究對象

1.試劑與耗材：配子受精培養液，血清蛋白替代物(SPS)，組織培養油均購買于美國SAGE公司，4℃冰箱保存。3001胚胎培養皿和定量移液管分別購買于美國 BD FALCON和美國COSTAR公司。熱平板(MATS-UST2)為日本Tokai hit公司產品，使用前校準至37℃。研究中涉及的大型箱式培養箱(C200，Labotect，德國)(#1)，小型箱式培養箱(APM-30D，Astec，日本)(#2)，桌面干式培養箱(EC9-230L1，Astec，日本)(#3)，桌面濕式培養箱(K-MINC-100，COOK，美國)(#4)為胚胎實驗室常用的三氣CO2培養箱，設置參數至37℃，5%CO2，5%O2。溫度測定儀(EA11A)購買于美國Extech公司，手工將其溫度探頭與3001胚胎培養皿皿蓋偶聯(圖1)，用于測定培養皿中微滴溫度，使用前參照產品說明書校準。

二、研究方法

1.本研究涉及4種不同類型的商品化培養箱，1號(#1)為大型箱式培養箱；2號(#2)為小型箱式培養箱；3號(#3)為桌面干式培養箱；4號(#4)為桌面濕式培養箱。

2.培養皿及微滴準備：實驗培養皿及微滴與胚胎培養室常規工作中的培養皿及微滴準備方法相同。即在3001胚胎培養皿中加入35 μl含10% SPS的配子受精培養液并立即加入2.5 ml組織培養油。準備好的培養皿放置37℃，5%CO2，5%O2條件下平衡。

3.熱平板上微滴溫度測量：連接培養皿中的溫度探頭至溫度測定儀，待溫度穩定后讀數，快速取出，置于熱平板上，每隔30 s記錄一次溫度測定儀示數，共記錄30 min(圖1)。該測量進行3次生物學重復。

圖1 培養皿微滴溫度測定示意圖

4.培養箱內微滴溫度測量：取出平衡后的培養皿，溫度下降至30℃時，快速放回培養箱，記錄溫度每升高0.5℃所需時間，直到最終穩定在37℃。每種型號培養箱共進行3次生物學重復。

三、統計學分析

采用SPSS 24.0統計軟件進行數據的統計分析，均數比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、測量時培養室內環境

培養室內環境如溫濕度是胚胎培養室每日常規質量控制指標，胚胎培養過程中需要維持實驗室內環境的穩定。本實驗在胚胎實驗室進行，測量時培養室內的溫度為(25.0±0.5)℃，相對濕度為(73%±7.8%)，實驗中均關閉百級層流系統，每次測量時培養室內環境保持相對穩定。

二、熱平板上微滴溫度變化

隨著培養皿離開CO2培養箱，在熱平板上操作時間的延長，微滴內的溫度呈現逐漸降低的趨勢(圖2)。離箱操作3 min，微滴溫度降至(36.50±0.52)℃；離箱操作5 min，微滴溫度降至(36.17±0.67)℃；10 min時降至(35.53±0.64)℃；10 min以后，微滴溫度趨于平穩，直到30 min時，微滴溫度仍能維持在(35.23±0.21)℃。

圖2 培養皿中微滴在熱平板上溫度變化

三、不同類型商品化培養箱中微滴復溫時間

#1至#4培養箱中微滴溫度由30℃恢復至37℃的時間分別為(10.13±1.86)min、(24.71±4.37)min、(8.69±0.58)min、(8.59±2.01)min；由35℃恢復至37℃的時間分別為(5.58±1.37)min、(15.69±5.19)min、(5.21±0.45)min、(4.88±0.51)min。其中#2培養箱由30℃及35℃恢復至37℃的復溫時間均顯著長于#1、#3、#4培養箱(P<0.05)，#4培養箱恢復至37℃的時間最短，但統計學上#1、#3、#4培養箱的復溫時間無顯著性差異(P>0.05)(圖3)。

注：與#1、#3、#4 CO2培養箱相比，*P<0.05圖3 不同類型商品化培養箱中微滴復溫時間

討 論

體外胚胎培養是IVF-ET過程涉及的主要環節之一，胚胎的質量直接影響移植后的最終臨床結局。除去配子及胚胎本身質量外，影響胚胎培養的外部因素很多。從胚胎實驗室角度，主要有環境因素、操作因素等，其中環境因素多而復雜，影響明顯。環境因素主要包括培養室內環境、培養箱內環境、培養皿微滴內環境，如溫度、pH等。然而，由于監控的復雜性，目前胚胎實驗室廣泛關注的是培養室內環境及培養箱內環境，很少對培養皿微滴內的環境進行質量控制。但是培養皿微滴是胚胎直接接觸的液體環境，相當于母體子宮，所以微滴內的環境才是關鍵的因素之一。因此，本研究關注于胚胎培養皿微滴內的環境，通過自組裝的一套簡易裝置實現對培養皿微滴內溫度的監控，探究培養皿離開培養箱放置于熱平板上的溫度改變情況以及重新放回培養箱后的復溫時間，指導實驗室日常工作，為胚胎培養體外操作及如何選擇更加適合的培養箱提供重要依據。

溫度對胚胎發育的影響顯而易見，人的基礎體溫是37℃，常規理論認為，37℃是配子體外受精及胚胎發育的最適溫度[3-4]。然而，有動物研究表明，輸卵管局部的溫度低于中心體溫1.5℃左右[5-8]，而人卵泡內溫度甚至比中心體溫低2.3℃[9-10]。因此，根據“回歸自然”(back to nature)的胚胎培養理念提出，比37℃略低的溫度(如36℃)可能更有利于胚胎發育[9]。Higdon等[11]一項回顧性研究結果也表明，36℃的培養箱環境能夠提高臨床妊娠率。Hong等[12]的前瞻性隨機對照(RCT)研究結果表明，相比36℃培養環境，傳統的37℃條件培養，能夠獲得更好的第3天胚胎及更高的囊胚形成率，但是胚胎非整倍體率及移植后的妊娠率無顯著性差異。因此，目前對于胚胎培養的最適溫度仍然存在著爭議。但是，過低的溫度對于配子及胚胎的損傷是明確的，低溫除了降低胚胎內正常代謝外，主要影響紡錘體的形態及穩定性，對其他細胞期的影響也是不可避免的，造成不可逆的細胞損傷，影響胚胎質量及種植潛能，導致受精率，卵裂率和妊娠率下降[13-16]。有研究表明，成熟卵母細胞在33℃下，紡錘體會在5 min內開始解聚，10 min內完全消失，隨著溫度的降低，完全消失的時間將逐漸縮短，紡錘體恢復的時間將延長，甚至是永久性損傷[17]，低溫也會使得卵母細胞的非整倍體幾率增加[18]。

體外胚胎培養過程中，目前仍無法實現從開始到結束胚胎始終不離開培養箱，因此，低于37℃的溫度是不可避免的，主要出現在兩種情況：一種是從培養箱取出胚胎培養皿放置于恒溫熱平臺上進行離箱操作及觀察；另外一種是培養皿從箱外回到培養箱尚未恢復溫度。因此，離箱操作所用時間內引起的培養皿微滴溫度變化幅度及培養箱復溫能力十分重要。本研究結果表明，培養皿離開CO2培養箱，隨著在熱平板上操作時間的延長，微滴內的溫度呈現逐漸降低，前10 min內每分鐘溫度降低約0.16℃。10 min以后，微滴溫度趨于平穩。由于目前對于胚胎培養的最適溫度仍有爭議，所以對于溫度低于多少開始對配子及胚胎產生影響尚不明確，2010年美國生殖年會上，Sherbhn[19]在報告中提到，取卵時卵泡液溫度超過36.4～36.9℃這一范圍，將影響胚胎囊胚形成率、著床率及活產率，提示配子及胚胎在體外離開培養箱后，溫度降至36.4℃下，可能開始對后期發育產生影響。因此，結合本研究結果，為保證在熱平板上微滴內的溫度能夠維持在36.4℃以上，建議離箱操作配子及胚胎的時間應盡量控制在3 min以內，對于卵母細胞數或者胚胎數較多的情況，可以采用分批操作的方法，減少每一批次體外操作的時間，從而維持胚胎在一個適宜的環境下。完成離箱觀察和操作的配子應立即放回培養箱中恢復至適宜溫度。因此，選擇合適的胚胎培養箱，在最短的時間內恢復培養皿中微滴溫度也非常必要。

CO2培養箱是胚胎實驗室的最常用的設備之一，主要用于控制胚胎培養環境。通過在培養箱內模擬形成一個類似人體內的生長環境，即穩定的溫度、O2水平、CO2水平、相對濕度等，目前商品化培養箱品牌多、種類雜。如何選擇一個好的培養箱尚缺乏行之有效的指標，不同的研究者也有不同的結論[20]。其中，復溫時間可能是一個十分重要的參考指標。本研究系統性的檢測了目前市面上比較典型的大型箱式培養箱(#1)，小型箱式培養箱(#2)，桌面干式培養箱(#3)和桌面濕式培養箱(#4)的復溫時間。結果顯示微滴在4種不同類型的CO2培養箱中由30℃恢復至37℃的時間存在差異，分別為(10.13±1.86)min、(8.69±0.58)min、(24.71±4.37)min、(8.59±2.01)min，由35℃恢復至37℃的時間分別為(5.58±1.37)min、(5.21±0.45)min、(15.69±5.19)min、(4.88±0.51)min。其中，#2小型箱式培養箱的復溫時間顯著長于#1、#3、#4培養箱(P<0.05)，#4培養箱的復溫速率最快，恢復至37℃所用時間最短，但#1、#3、#4培養箱的復溫時間彼此之間無顯著性差異(P>0.05)。因此，從溫度方面進行考慮，應盡可能選擇復溫時間較短的培養箱進行胚胎培養，而在熱平板上進行體外操作及觀察時則盡可能將時間控制在3 min之內。若需在實驗室進行不同培養箱的數據監控，則還需要結合其他指標，如pH的控制、系統穩定性、以及使用的便捷性等數據。當然，無論選擇何種胚胎培養箱，最終還是應關注胚胎的生長發育結局及臨床結局，才能更好的對實驗室進行質量控制。