腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌對冷藏凡納濱對蝦蝦汁品質的影響

謝 晶，葉晶鑫，楊勝平，程 穎，林祖權，錢韻芳

（上海海洋大學食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306）

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）又稱南美白對蝦，是一種高品質經濟養殖蝦類品種，其養殖產量和銷售量在全球許多地區持續增加，特別是在中國和馬來西亞等地區[1-2]。但凡納濱對蝦豐富的營養價值，尤其是較高含量的蛋白質，使其在貯藏中極易被微生物分解，降低其營養價值[3-5]。冷藏是延長食品貨架期最常用的方法，但是仍然有部分微生物能在低溫下生長，即特定腐敗菌[6-7]，是少數幾種能夠在一定條件下生長繁殖成為優勢菌群并代謝產生腐敗產物，最終導致食品腐敗變質的微生物。水產品中常見的腐敗菌有希瓦氏菌、假單胞菌、氣單胞菌和不動桿菌等。但是水產品中腐敗菌的種類和比例受品種、捕獲季節、貯藏環境等因素的影響而有較大的差異[8]。前期研究發現冷藏凡納濱對蝦中的特定腐敗菌是腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens），它們都是革蘭氏陰性菌，有嗜冷性。S. putrefaciens可以產生大量的三甲胺和腐敗揮發性物質，而P. fluorescens降解蛋白質的能力強[9-10]。近年來，關于單一腐敗菌的致腐敗能力的研究比較多，但是在冷藏條件下微生物的生長和對食品致腐敗能力與微生物之間的相互作用息息相關。Mejlholm等[11]在冷藏條件下將肉毒桿菌（Carnobacterium maltaromaticum）和熱死環絲菌（Brochothrix thermosphacta）混合接種至對蝦上，發現一些揮發性腐敗異味只出現在混合接菌組中，Laursen等[12]進一步研究發現是這兩種菌形成的代謝產物之間的相互作用產生了這種特殊的腐敗異味。因此需要進一步研究微生物之間的相互作用對食品腐敗產生的影響，而且目前關于S. putrefaciens和P. fluorescens的相互作用對凡納濱對蝦的致腐敗作用的研究較少。

為研究凡納濱對蝦特定腐敗菌和特定腐敗菌在低溫貯藏下的相互影響，本實驗將S. putrefaciens和P. fluorescens接種到無菌蝦汁中，以便為開發新型凡納濱對蝦等水產品的保鮮技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凡納濱對蝦購于上海市浦東新區古棕路農工商超市，充氧保活運至實驗室。立即用碎冰猝死，去頭、去尾、去殼、去腸腺、清洗，用于制備無菌蝦汁。

鐵瓊脂培養基、假單胞菌選擇性培養基、腦心浸肉湯、胰蛋白胨大豆肉湯培養基 青島海博生物技術有限公司；輕質氧化鎂、硼酸、鹽酸、檸檬酸鈉、高氯酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、丹酰氯、濃氨水、乙腈等 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TDL-5-型低速離心機 上海隆拓儀器設備有限公司；HVE-50滅菌鍋 日本Hirayama制造有限公司；VS-1300L-U超凈工作臺 上海康福特環境科技有限公司；THZ-100恒溫培養搖床 上海圣科儀器設備有限公司；DHP-9162低溫培養箱 日本三洋電器集團有限公司；Kjeltec2300凱氏定氮儀 丹麥Foss公司；835氨基酸分析儀 日本日立公司；2695高效液相色譜系統、2996二極管陣列檢測器及Empower色譜管理軟件 美國Waters有限公司；PowerPac HV Power Supply蛋白電泳分析儀美國Bio-Rad生命醫學產品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 前處理

1.3.1.1 S. putrefaciens和P. fluorescens菌懸液的制備

參照Parlapani等[13]的方法略有修改：取1 mL凍存的S. putrefaciens菌液于滅菌的9 mL腦心浸肉湯中活化18 h后，再取1 mL菌液接種于9 mL胰蛋白胨大豆肉湯培養基中活化，培養8 h左右使菌液濃度達1.0×108CFU/mL后，用于無菌蝦汁的接種。P. fluorescens菌懸液的制備方法同S. putrefaciens。

1.3.1.2 無菌蝦汁的制備

參考Fall等[14]的方法制備無菌蝦汁：鮮活凡納濱對蝦→去頭、去尾、去殼、去腸腺、清洗→添加2 倍蝦肉的蒸餾水后用榨汁機攪碎→100 ℃水浴鍋中加熱4 min→冷卻后用紗布過濾蝦汁→分裝（100 mL/瓶）→添加2.00 g NaCl/瓶→高壓滅菌鍋121 ℃下滅菌30 min備用

1.3.1.3 接種與貯藏

將滅菌好的蝦汁冷卻至室溫，隨機分為4 組，其中接菌組每個錐形瓶中分別加入500 μL S. putrefaciens（S組）或P. fluorescens（P組）菌液，混合接菌組（SP組）分別吸取250 μL兩種菌液加入蝦汁中。以不接菌的蝦汁為對照組（CK組），然后置于4 ℃恒溫箱中貯藏8 d。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 微生物指標的測定

參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[15]中的平板計數法測定。用鐵瓊脂、假單胞菌選擇性培養基分別測單獨接菌組和混合接菌組中S. putrefaciens和P. fluorescens的菌落數，用鐵瓊脂選擇性培養基測不接菌的蝦汁（CK組）的菌落數。

1.3.2.2 TVB-N含量的測定

參照Dabadé等[16]的方法測定凡納濱對蝦中的總揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量，每組樣品做2 個平行，取平均值。取3.00 mL蝦汁，加入少量的蒸餾水，采用半微量凱氏定氮法進行測定。

1.3.2.3 氨基酸含量的測定

氨基酸含量的測定采用GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》[17]所規定的方法。取200 μL蝦汁放入水解管中水解，再取1.00 mL過0.22 μm濾膜進樣，氨基酸分析儀測定，每組樣品做2 個平行。

1.3.2.4 腐胺含量的測定

凡納濱對蝦中生物胺的提取參照Ikoni?[18]、Eerola[19]等的方法，然后參照Fan Hongbin等[20]的方法使用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法進行鑒定并定量分析生物胺含量，每組樣品做3 次平行。

1.3.2.5 蝦汁肌漿蛋白SDS-PAGE分析

參考Ramírez-Guerra等[21]的方法提取蝦肉中肌漿蛋白。取蝦汁40 μL，加入100 μL磷酸鹽緩沖液A（15.6 mmol/L Na2HPO4、3.5 mmol/L KH2PO4、pI 0.05、pH 7.5）稀釋。

參考Qian Yunfang等[1]的方法將樣品與上樣緩沖液（2.0 mL 0.5 mol/L Tris-HCl溶液（pH6.8）、4.0 mL 10 g/100 mL十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、2.0 mL甘油、0.2 mL 1 g/100 mL溴酚藍、1.8 mL蒸餾水）按體積比1∶1比例混合，在90 ℃條件下加熱9 min；上樣至12%的預制膠中并在150 V下進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）。電泳完成后經考馬斯亮藍R250染色后洗脫并分析。

1.3.2.6 電子鼻檢測

參考顧賽麒等[22]的方法將新鮮樣品以及貯藏8 d的CK（CK8）、S（S8）、P（P8）、SP（SP8）5 組樣品（每組4 次平行）進行電子鼻檢測。各組于50 ℃平衡400 s后，以潔凈的干燥空氣為載氣，流速150 mL/min，延滯時間10 min。通過電子鼻Winmuster分析軟件對采集到的數據進行分析。

1.4 數據處理

利用Origin 8.6軟件繪制曲線；采用SPSS 19軟件進行ANOVA差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同處理對凡納濱對蝦蝦汁中菌落數的影響

圖1 接菌蝦汁在4 ℃貯藏7 d菌落數的變化Fig. 1 Synergistic growth of S. putrefaciens and P. fluorescens in shrimp juice during storage at 4 ℃ for 7 days

圖1 為在4 ℃條件下的凡納濱對蝦蝦汁中S. putrefaciens和P. fluorescens的菌落數變化趨勢圖。初始接菌量約為5.30（lg（CFU/mL））。從圖1中可以看出，單獨接種S. putrefaciens的菌落數始終高于P組，且呈現顯著差異（P＜0.05），從2 d開始，單獨接種S. putrefaciens的菌落數就已經達到7.08（lg（CFU/mL）），說明在4 ℃冷藏凡納濱對蝦蝦汁中S. putrefaciens的生長繁殖能力高于P. fluorescens，與前期研究發現冷藏凡納濱對蝦菌群中S. putrefaciens的相對豐度高于P. fluorescens[23]相一致。SP組中的S. putrefaciens和P. fluorescens的菌落數在貯藏7 d后分別達到8.85（lg（CFU/mL））和8.26（lg（CFU/mL）），都顯著高于單獨接菌組（P＜0.05），表明這兩種微生物存在相互促進作用。Joffraud等[24]研究發現發光桿菌（Photobacterium phosphoreum）和弧菌（Vibrio sp.）可以縮短棲魚肉食桿菌（Carnobacterium piscicola）的延滯期，Laursen等[12]發現肉食桿菌（Carnobacterium maltaromaticum）可以促進熱死環絲菌（Brochothrix thermosphacta）的生長。

2.2 不同處理對凡納濱對蝦蝦汁中TVB-N含量的影響

圖2 接菌蝦汁在4 ℃貯藏中TVB-N含量的變化Fig. 2 TVB-N contents of Pacific white shrimp juice during storage at 4 ℃

在微生物和酶的共同作用下，水產品中含量較高的蛋白質被分解而產生的氨以及胺類等含氮物質統稱為TVB-N[25]。TVB-N是評判水產品的鮮度和微生物引起水產品腐敗程度的重要指標[26]，由圖2可知，3 組接菌組的TVB-N含量上升較快，與CK組有顯著性差異，表明接菌組TVB-N含量的上升與其接種的微生物生長代謝活動有關，CK組因經過高溫滅菌微生物數量較少，因此TVB-N含量上升緩慢。在接菌的初期TVB-N含量升高緩慢，2 d后迅速上升，說明微生物數量達到一定數量后，腐敗產物才會進入快速形成階段。P組的TVB-N含量較S組低，說明S. putrefaciens對凡納濱對蝦的致腐敗能力比P. fluorescens強，這與圖1中菌落數的變化一致。SP組的TVB-N含量在貯藏7 d后達到16.19 mg/100 mL，較單獨接菌組高，說明這兩種腐敗菌具有協同作用，其致腐敗能力高于單獨接菌組；這可能是因為這兩種腐敗菌可分泌促進雙方生長的信號分子[27]。

2.3 不同處理對凡納濱對蝦蝦汁中氨基酸含量的影響

表1 接菌蝦汁在4 ℃貯藏8 d后氨基酸含量的變化Table1 Total amino acid contents of uninoculated and inoculated Pacific white shrimp juice during storage at 4 ℃ for 8 days mg/g

有機體蛋白質組織的基本成分是氨基酸，其在生物體的生命活動中發揮著非常重要的作用[28-29]。從表1中可以看出，與新鮮樣品對比，貯藏終點的接菌組中各種氨基酸的含量降低。貯藏8 d后，S組中Asp、Ala、Leu和His等各氨基酸和總氨基酸的含量均低于P組，但高于SP組，說明在4 ℃貯藏中S. putrefaciens的氨基酸降解能力高于P. fluorescens，而二者可協同加速氨基酸的降解。

2.4 不同處理對凡納濱對蝦蝦汁中生物胺含量的影響

圖3 接菌蝦汁在4 ℃貯藏中腐胺含量的變化Fig. 3 Putrescine contents of Pacific white shrimp juice during storage at 4 ℃

S. putrefaciens和P. fluorescens可以使高蛋白水產品中鳥氨酸、賴氨酸和組氨酸發生脫羧作用生成腐胺、尸胺和少量組胺，隨著貯藏時間的延長，微生物產生的生物胺的含量升高，有害物質積累，水產品的新鮮程度逐漸降低。腐胺是凡納濱對蝦腐敗過程中最主要的生物胺[30-31]。從圖3可看出，CK組的腐胺含量幾乎沒有上升，而且在任何時間段，S組的腐胺含量都比P組高，說明在4 ℃貯藏下S. putrefaciens的致腐敗能力強于P. fluorescens。SP組在2 d后腐胺含量迅速上升，高于單獨接菌組，在4 d時SP組的腐胺含量為50.43 mg/100 mL，比S組的含量高45.46%；說明S. putrefaciens和P. fluorescens在蝦汁中的協同作用會促進微生物代謝產生脫羧酶，形成生物胺，提高對凡納濱對蝦的致腐敗能力。在4～6 d時，3 個接菌組的腐胺含量略有下降，這可能是因為低溫環境下微生物進入穩定期后，代謝活性降低，同時腐胺也有可能被分解，這與孫亞軍[32]的研究結果一致。

2.5 不同處理對凡納濱對蝦蝦汁中肌漿蛋白的影響

圖4 接菌蝦汁在4 ℃貯藏中肌漿蛋白的變化Fig. 4 SDS-PAGE pattern of myogens in Pacific white shrimp during storage at 4 ℃

圖4 是通過SDS-PAGE法分析了4 ℃貯藏3 d和7 d時，3 種接菌方式對凡納濱對蝦肌漿蛋白的影響。可以看出，凡納濱對蝦蝦汁在4 ℃貯藏3 d和7 d后，相比于S組和P組，SP組的蛋白條帶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的灰度略有降低，說明混合接菌處理加速了對肌漿蛋白的降解，對凡納濱對蝦蝦汁的致腐敗能力較強。

2.6 不同處理對凡納濱對蝦蝦汁中揮發性氣味的影響

圖5 接菌蝦汁在4 ℃貯藏中香氣輪廓PCA圖Fig. 5 PCA chart for aroma profiles of Pacific white shrimp juice during storage at 4 ℃

主成分分析（principal component analysis，PCA）可以根據不同接菌組產生的揮發性物質的相似性和差異性將復雜的信息更加直觀地展現出來[33-34]。食品中微生物的迅速繁殖導致了腐敗代謝產物的產生，包括感官不可接受的腐敗揮發性物質。由圖5可知，各組數據采集點所在的區域無重疊，說明主成分分析法適用于不同接菌組中揮發性物質的分析。第一主成分的貢獻率為97.43%，第二主成分的貢獻率為1.62%，兩者的總貢獻率為99.05%，說明所受干擾較小，可以將不同接菌組的腐敗情況完全區分開。貯藏8 d后的CK組和P組，與貯藏8 d后的SP組和S組在PC1軸差異較大，表明電子鼻區分以上組別主要是第一主成分起作用。接菌組中與新鮮樣品差異最大的是貯藏8 d的S組，其次是SP組，與新鮮樣品差異最小的單獨接種組是P. fluorescens組，說明S. putrefaciens在4 ℃貯藏8 d后產生的腐敗揮發性物質的能力最強，在S. putrefaciens存在的條件下可以加速P. fluorescens產生腐敗代謝產物，提高其腐敗活性，與Mejlholm等[11]的研究結果一致。兩種菌在混合培養的條件下才會產生某種腐敗揮發性物質，可能是這兩種菌形成的代謝產物之間的相互作用所致[12]。

3 結 論

本實驗主要研究了凡納濱對蝦中的主要腐敗微生物S. putrefaciens和P. fluorescens之間的相互作用。通過菌落數分析發現S. putrefaciens比P. fluorescens更適應于在4 ℃的蝦汁中生長。相比于單獨接菌組，混合接菌組中的TVB-N含量和腐胺含量更高，說明兩種菌混合培養能相互提高彼此的致腐敗能力。本研究有助于加深對水產品復雜菌群體系中微生物相互作用方式的了解，為開發新型凡納濱對蝦等水產品的保鮮技術提供了一定的理論依據。