甘草酸提取廢液α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選與鑒定

余 穎，樊金玲,，程源斌，朱文學

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.洛陽藍斯利科技有限公司，河南 洛陽 471023）

α-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.20）是人體消化碳水化合物的關鍵酶[1-2]，催化水解低聚糖底物非還原末端的α-1,4-糖苷鍵，釋放出α-D-葡萄糖[3-4]。α-葡萄糖苷酶抑制劑可通過抑制人體腸道內α-葡萄糖苷酶活性，延緩食物中碳水化合物的水解，從而減慢糖的吸收，降低餐后血糖水平[5-6]，可用于防治II型糖尿病及其并發癥[7]。由于藥物合成的α-葡萄糖苷酶抑制劑的不良反應屢有報道[8]，因此從天然動植物及食品中開發α-葡萄糖苷酶抑制劑，用于降血糖功能性食品及功能性食品配料具有重要意義[9-12]。

甘草是我國衛生與計劃生育委員會委頒布的藥食同源的多年生草本植物[13]，其蘊藏量豐富，在中、西方食品和藥品中均有廣泛應用[14-15]。其主要的利用形式之一是提取甘草酸，提酸后的甘草藥渣和廢液則被遺棄，造成了極大的環境污染和資源浪費[16-17]。近年來研究表明，甘草的水提取物和乙醇提取物均對α-葡萄糖苷酶具有顯著的抑制活性[18-19]，其中甘草黃酮、甘草酸是主要的活性物質，例如：甘草酚、甘草異黃酮乙、甘草異黃酮甲等具有較高的α-葡萄糖苷酶抑制活性[20-25]。本實驗從甘草酸的工業生產出發，對甘草酸提取廢液進行梯度萃取，研究不同溶劑萃取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性，探討抑制活性最強的萃取相對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型及其與阿卡波糖的協同作用，并采用超高效液相色譜-二極管陣列檢測-質譜（ultra high performance liquid chromatography with diode array detector mass spectrometry，UHPLC-DAD-MS）等多種方法對其主要成分的化學結構進行分析鑒定，同時測定了主要成分的含量。本研究為甘草及甘草酸提取廢液的綜合開發和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘草酸提取廢料由洛陽藍斯利科技有限公司提供。

α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖、甘草素、異甘草素、柚皮素、芒柄花素 上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖測定試劑盒 中生北控生物科技股份有限公司；萃取用有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Model 680全自動酶標儀 美國Bio-Rad公司；1260高效液相色譜儀、6520 四極桿-飛行時間-質譜（quadrupole-time of flight-mass spectrometry，Q-TOFMS）儀 美國Agilent 公司；RE52CS-1旋轉蒸發儀上海亞榮生化儀器廠；SCIENTZ-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技有限公司；101-2A電熱鼓風干燥箱 天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

甘草酸提取廢液濃縮物依次用正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取3 次（體積比1∶1），分別合并各萃取液。各萃取液和萃余水相經真空減壓濃縮和真空冷凍干燥分別得正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取相和水相。冷藏備用，使用前用甲醇復溶。

1.3.2 樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

測定甘草酸提取廢液及其各萃取相和萃余水相對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，其具體方法參考文獻[26]，并作部分修改。取α-葡萄糖苷酶溶液（50 U/mL，pH 6.86磷酸鹽緩沖液溶解）40 μL于96 孔酶標板中，加入20 μL不同質量濃度（0.00、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.0 g/L）樣品（甲醇溶解），置于37 ℃恒溫箱中預熱15 min；加入10 mmol/L麥芽糖（pH 6.86磷酸鹽緩沖液溶解）40 μL，37 ℃保溫反應30 min；然后加入0.1 mol/L Na2CO3100 μL終止反應。取上述反應液50 μL，加入葡萄糖測定試劑盒中的葡萄糖工作液150 μL，充分混勻，37 ℃反應30 min，于505 nm波長處檢測吸光度A。每個樣品重復測定4 孔，取平均值。按式（1）計算樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率，并通過方程擬合計算半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。式（1）中酶空白組、樣品組、樣品背景組的反應體系見表1。同時，按上述方法測定不同質量濃度阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率和IC50。

表1 α-葡萄糖苷酶活性反應體系Table1 Reaction system for α-glucosidase activity

1.3.3 樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型

分析1.3.2節實驗中IC50最小的樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型。按照1.3.2節方法，設定樣品質量濃度范圍為0～1 g/L；在樣品某一確定質量濃度下，改變反應體系中麥芽糖濃度（0～500 mmol/L），測定反應液的吸光度。根據Lineweaver-Burk雙倒數曲線圖，判斷樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型。具體方法詳見參考文獻[27]。其中，Lineweaver-Burk雙倒數曲線圖是由酶促反應速率的倒數（1/V）對麥芽糖底物濃度的倒數（1/S）作圖，x和y軸上的截距分別代表米氏常數（Km）和最大反應速率（Vmax）的倒數。

1.3.4 樣品與阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的協同抑制作用分析1.3.2節實驗中IC50最小的樣品與阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的協同抑制作用。基于1.3.2節實驗得到的樣品與阿卡波糖的IC50，分別配制7 個質量濃度（0.25 IC50、0.50 IC50、1.00 IC50、1.50 IC50、2.00 IC50、2.50 IC50、5.00 IC50）的樣品和阿卡波糖溶液，并按體積比1∶1混合，按1.3.2節方法測定混合液對α-葡萄糖苷酶的抑制率。按式（2）計算聯合作用指數（combination index，CI）；CI＜1、CI＝1、CI＞1分別代表協同作用、加和作用和拮抗作用[28-31]。

式中：ρ1表示某一抑制率下混合液中提取物的質量濃度/（g/L）；ρ2表示某一抑制率下混合液中阿卡波糖的質量濃度/（g/L）；ρ1′表示相同抑制率下提取物單獨作用的質量濃度/（g/L）；ρ2′表示相同抑制率下阿卡波糖單獨作用的質量濃度/（g/L）。

1.3.5 樣品酸水解

稱取1.3.2節實驗中IC50最小的樣品25 mg，溶于3 mL質量分數1% HCl-CH3OH溶液，再加入2 mL 2 mol/L HCl溶液，混合均勻，密封置于100 ℃沸水浴中反應130 min。取出室溫冷卻，用質量分數1% HCl-CH3OH溶液補充體積至5 mL，0.45 μm微孔濾膜（有機系）過濾后冷藏備用。

1.3.6 UHPLC-DAD-MS分析

對1.3.2節實驗中IC50最小的樣品進行UHPLC-DAD-MS分析。

色譜條件：SB-C18柱（100 mm×4.6 mm，1.8 μm）；以乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～20 min，5%～100% A）；流速：0.4 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫 25℃；DAD檢測器，檢測波長：λ1＝276 nm、λ2＝372 nm。

TOF-MS條件：電噴霧離子源；TOF-MS檢測器；氣體溫度：350℃；干燥氣體流速：5 mL/min；毛細管電壓：4 000 V；碎裂電壓：150 V。

1.3.7 樣品主要成分的含量測定

HPLC分析：采用HPLC法測定酸水解樣品中各成分的含量。色譜柱：ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇（A）和1%冰醋酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～20 min，25%～40% A；20～60 min，40%～100% A）；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫30 ℃；DAD檢測器，檢測波長：λ1＝276 nm、λ2＝372 nm。

標準曲線的制作：稱取一定量的標準品，用甲醇配制系列質量濃度的標準品使用液，按上述方法進行分析檢測。以溶液質量濃度（甘草素質量濃度單位mg/mL，其余為μg/mL）為橫坐標，以峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得到回歸方程分別為：甘草素（276 nm）：y＝37 293x＋1 381.4（R2＝0.999 8）；柚皮素（276 nm）：y＝18.193x＋6.12（R2＝0.999 9）；異甘草素（372 nm）：y＝44.153x＋75.745（R2＝0.999 9）；芒柄花素（276 nm）：y＝29.107x＋28.13（R2＝0.999 9）。

含量計算：酸水解樣品中4 種主要的黃酮苷元（即甘草素、柚皮素、異甘草素以及芒柄花素）的含量按式（3）計算。

式中：ρ表示酸水解樣品中黃酮苷元（甘草素、柚皮素、異甘草素、芒柄花素）的質量濃度/（mg/mL）；ρ′表示酸水解樣品的質量濃度/（mg/mL）。

未酸水解樣品的主要化學成分為上述苷元的單糖苷和二糖苷。各黃酮苷元（甘草素、柚皮素、異甘草素、芒柄花素）的相對分子質量Mr分別以256.25、272.25、256.25、268.26計，糖苷平均分子相對分子質量Mr以240計，折合成糖苷的平均相對分子質量Mr′分別以496.25、515.25、496.25、508.26計。按式（4）計算以測定所得各苷元的含量折合成各類糖苷的總含量。

式中：Mr表示各黃酮苷元的相對分子質量；Mr′表示各黃酮苷元折合成糖苷的平均相對分子質量；w表示黃酮苷元含量/%。

2 結果與分析

2.1 甘草酸廢液提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用比較

甘草酸提取廢液及其各萃取相和萃余水相對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用如圖l所示。根據圖1數據擬合方程得到的IC50見表2。除正己烷相外，甘草酸提取廢液的各萃取相與甘草酸提取廢液相比，α-葡萄糖苷酶抑制活性均有不同程度的提高。其中，抑制活性最強的是乙酸乙酯萃取相，IC50為0.152 9 g/L（得率為5.65%）；其次為水相，IC50為0.618 9 g/L（得率為83.54%）。由于乙酸乙酯萃取相對α-葡萄糖苷酶的抑制活性最強，因此，后續實驗均以此相為研究對象。

圖1 甘草酸提取廢液及其萃取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig. 1 Inhibitory effect of glycyrrhizic acid extraction waste liquid against α-glucosidase

表2 甘草酸提取廢液及其萃取物對α-葡萄糖苷酶的IC50和得率Table2 IC50 and yield of extracts with α-glucosidase inhibitory activity from glycyrrhizic acid extraction waste liquid

2.2 乙酸乙酯相對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型

圖2 乙酸乙酯提取物對α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk雙倒數圖Fig. 2 Lineweaver-Burk double reciprocal plot for the inhibition of α-glucosidase by the ethyl acetate extract

按1.3.3節方法測定不同質量濃度乙酸乙酯萃取條件下麥芽糖底物濃度對α-葡萄糖苷酶催化速率的影響，根據Lineweaver-Burk雙倒數作圖。從圖2可以看出，隨著乙酸乙酯萃取相質量濃度的增大，縱軸截距不變，斜率增大，即Vmax不隨著抑制劑質量濃度增大而變化，米氏常數Km隨著抑制劑質量濃度的增大而不斷增大，表明抑制劑質量濃度增大時，酶對底物的親和力在不斷下降，抑制劑的存在阻礙了底物和酶的結合，增加底物濃度或抑制劑質量濃度均可排除對方對酶的效應，抑制劑對酶的抑制作用表現為競爭性抑制。競爭性抑制劑只能與游離酶結合，不能與酶-底物配合物結合。以不同質量濃度抑制劑測定的表觀米氏常數值（Kmapp）對抑制劑質量濃度（ρI）作圖為一條直線（圖2內插圖），直線所得橫軸截距為－Ki，即可以求得抑制常數Ki為0.085 1 g/L。

2.3 乙酸乙酯萃取相與阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的協同抑制作用

不同質量濃度的乙酸乙酯萃取物和阿卡波糖混合對α-葡萄糖苷酶的協同抑制作用見圖3，在所測的質量濃度范圍內，乙酸乙酯萃取物與阿卡波糖混合物的CI始終小于1，說明二者對α-葡萄糖苷酶存在協同抑制作用；CI呈現先增后降的趨勢，表明低劑量和高劑量條件下的乙酸乙酯萃取物和阿卡波糖的協同作用大于中等劑量。

圖3 乙酸乙酯萃取物和阿卡波糖混合液的CI曲線Fig. 3 CI plot of a mixture of ethyl acetate extract and acarbose

2.4 乙酸乙酯萃取相化學成分的初步鑒定

圖4 乙酸乙酯提取物的UHPLC色譜圖Fig. 4 UHPLC chromatograms of the ethyl acetate extract

采用UHPLC-DAD-MS對乙酸乙酯萃取相進行分析，其色譜圖如圖4所示。依據各色譜峰的光譜和質譜特征可看出：乙酸乙酯萃取相中的主要成分為黃酮類化合物。對其中相對豐度較高的15 個黃酮類化合物的光譜信息、質譜信息（準分子離子、特征裂片、中性丟失）進行解析，將其分為Ⅰ～Ⅴ類，初步確定了各黃酮化合物的苷元和糖基組成，詳見表3，苷元結構如圖5所示。

表3 乙酸乙酯萃取相的光譜、質譜特征及結構鑒定Table3 Spectral characteristics and structural identification of flavonoid compounds in the ethyl acetate extract

圖5 不同黃酮苷元結構圖Fig. 5 Structure of different flavonoid aglycones

類Ⅰ包括色譜峰1、3、6，其光譜的共同特征為：約在284 nm左右具有強的帶Ⅱ吸收，帶Ⅰ以肩峰形式出現或消失。此類化合物質譜的共同特征為：負離子檢測模式下苷元離子的m/z為271，苷元共同的碎片離子分別為177、151和107。結合光譜圖和以上特征碎片，推斷類Ⅰ化合物的苷元為柚皮素，m/z 151為[1,3A－H]－，m/z 107為[0,4A－H]－，m/z 177為苷元失去B環所得，即[苷元－H－B]－。峰1和峰3是同分異構體，其[M－H]－的m/z為433，丟失1 個六碳糖中性碎片162 u得到苷元離子m/z 271；因此，峰1和峰3均為柚皮素-六碳糖單糖苷。目前尚無法判斷峰1和3中糖苷鍵位置。峰6[M－H]－的m/z為565，丟失1 個五碳糖中性碎片132 u得到碎片離子m/z 433，再丟失1 個六碳糖中性碎片162 u得到苷元離子m/z 271；因此，峰6為柚皮素-六碳糖-五碳糖二糖苷。

類Ⅱ包括色譜峰2、4和5，其光譜的共同特征為：約在271～276 nm波長處具有強的帶Ⅱ吸收，帶Ⅰ以低強度峰的形式出現在313～316 nm波長處，表明此類化合物應為雙氫黃酮或雙氫黃酮醇。與類Ⅰ色譜峰相比，其帶Ⅱ吸收向短波移動10 nm左右，表明可能不存在5-羥基。此類化合物質譜的共同特征為：負離子檢測模式下苷元離子的m/z為255，苷元共同的碎片離子分別為135、119和91。結合光譜圖和以上特征碎片推斷此類化合物的苷元為甘草素，m/z 135為[1,3A－H]－，m/z 91為[0,4A－H]－，m/z 119為[1,3B－H]－。峰2[M－H]－的m/z為417，丟失1 個六碳糖中性碎片162 u得到苷元離子m/z 255；因此，峰2為甘草素-六碳糖單糖苷。峰4和峰5是同分異構體，其[M－H]－的m/z為549，丟失1 個五碳糖中性碎片132 u得到碎片離子m/z 417，再丟失1 個六碳糖中性碎片162 u得到苷元離子m/z 255；因此，峰4和峰5均為甘草素-六碳糖-五碳糖二糖苷。

類Ⅲ包括色譜峰7、9、10和12，其光譜的共同特征為：約在362～373 nm波長處具有強的帶Ⅰ吸收，帶Ⅱ以低強度峰形式出現在242～246 nm處，表明此類化合物應為查耳酮類。此類化合物質譜的共同特征為：負離子檢測模式下苷元離子的m/z為255，苷元共同的碎片離子分別為135、119和91。此類苷元碎片與類Ⅱ完全相同，但此類化合物的光譜圖顯著不同于類Ⅱ化合物，為查耳酮化合物。結合光譜圖和以上特征碎片推斷類Ⅲ化合物的苷元為異甘草素，m/z 135為[1A－H]－、m/z 91為[0A－H]－、m/z 119為[1B－H]－。峰7和峰10是同分異構體，其[M－H]－的m/z為549，丟失1 個五碳糖中性碎片132 u得到碎片離子m/z 417，再丟失1 個六碳糖中性碎片162 u得到苷元離子m/z 255；因此，峰7和峰10均為異甘草素-六碳糖-五碳糖二糖苷。峰9、12為同分異構體，其[M－H]－的m/z為417，丟失1 個六碳糖中性碎片162 u得到苷元離子m/z 255；因此，峰9、12為異甘草素-六碳糖單糖苷。

類Ⅳ包括色譜峰8和11，其光譜的特征為：約在251 nm波長處具有強的帶Ⅱ吸收，帶Ⅰ以肩峰的形式出現在306 nm波長處，表明此類化合物應為異黃酮化合物；其帶Ⅱ吸收出現在245～270 nm波長處，與雙氫黃酮或雙氫黃酮醇（帶Ⅱ吸收出現在270～295 nm波長處）有明顯區別。此類化合物質譜的共同特征為：負離子檢測模式下苷元離子的m/z為267，苷元共同的碎片離子較少。結合此類化合物的光譜圖，并查閱相關文獻[32]，推測此苷元為芒柄花素。其中，峰8的[M－H]－的m/z為561，丟失1 個五碳糖中性碎片132 u和1 個六碳糖中性碎片162 u得到苷元離子m/z 267；因此，峰8為芒柄花素-六碳糖-五碳糖二糖苷。峰11質譜圖中m/z 475為[M＋HCOO]－，丟失1 個六碳糖中性碎片162 u得到苷元離子m/z 267；因此，峰11為芒柄花素-六碳糖單糖苷。

類Ⅴ包括色譜峰13、14和15，其光譜的共同特征為：約在314～325 nm波長處具有強的帶Ⅰ吸收，帶Ⅱ以低強度峰或肩峰形式出現在281～283 nm波長處。此類化合物質譜的共同特征為：負離子檢測模式下苷元離子的m/z為255，苷元共同的碎片離子分別為135、119和91，與類Ⅱ、Ⅲ相同；但此類化合物光譜圖明顯不同于類Ⅱ、Ⅲ化合物，其帶Ⅰ吸收強于帶Ⅱ吸收，出現在314、323 nm和325 nm波長處，帶Ⅱ出現在281～283 nm波長處。峰13、14和15為同分異構體，其[M－H]－的m/z為725，丟失1 個六碳糖醛酸中性碎片176 u得到碎片離子m/z 549，再丟失1 個五碳糖中性碎片132 u得到m/z 417，再丟失1 個六碳糖中性碎片162 u苷元離子m/z 255；因此，峰13、14和15均為黃酮化合物的六碳糖醛酸-六碳糖-五碳糖三糖苷。尚不明確此類化合物的類別。

圖6 乙酸乙酯提取物水解物的HPLC圖Fig. 6 HPLC profile of the acid hydrolysate of the ethyl acetate extract

為了進一步確認推斷的乙酸乙酯萃取相的苷元結構，將其按1.3.5節方法進行酸水解，再經HPLC分析，其色譜圖如圖6所示。將水解產物中主要4 個色譜峰的保留時間和光譜圖與標準品進行了比較，結果表明：峰1為甘草素，峰2為柚皮素，峰3為異甘草素，峰4為芒柄花素（標準品的色譜圖及光譜圖略）。此結果表明苷元種類推斷正確。

2.5 乙酸乙酯萃取相主要成分的含量確定

將乙酸乙酯萃取相進行酸水解，采用HPLC法測定了水解液中4 種主要的黃酮苷元（即甘草素、柚皮素、異甘草素以及芒柄花素）的含量。甘草素、柚皮素、異甘草素、芒柄花素分別為14.50%、1.56%、6.09%、2.31%。由于乙酸乙酯萃取相主要成分為上述苷元的單糖苷和二糖苷，將測定所得各苷元的含量折合成各類糖苷的總含量。甘草素類、柚皮素類、異甘草素類、芒柄花素類的黃酮含量總計分別為28.08%、2.95%、11.80%、4.38%；黃酮總含量為47.21%。

3 結 論

在甘草酸提取廢液及其各萃取相和萃余水相對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用中，乙酸乙酯萃取相具有最強的抑制活性，IC50為0.152 9 g/L，抑制類型表現為競爭性抑制，抑制常數Ki＝0.085 1 g/L，且與阿卡波糖混合對α-葡萄糖苷酶存在協同抑制作用。乙酸乙酯萃取相中的主要化學成分為黃酮類化合物，初步確定了各黃酮化合物的苷元和糖基組成為甘草素、柚皮素、異甘草素以及芒柄花素的單糖苷和二糖苷。乙酸乙酯萃取相水解液中4 種主要的黃酮苷元（即甘草素、柚皮素、異甘草素以及芒柄花素）的含量分別為：14.50%、1.56%、6.09%和2.31%。將測定所得各苷元的含量折合成各類糖苷的總含量，則甘草素類、柚皮素類、異甘草素類和芒柄花素類的黃酮含量總計分別為28.08%、2.95%、11.80%和4.38%；黃酮總含量為47.21%。