腐敗希瓦氏菌及其與蜂房哈夫尼亞菌共培養對冷藏大菱鲆的致腐能力

李婷婷，馬 艷，李學鵬，儀淑敏，勵建榮,

（1.大連民族大學生命科學學院，生物技術與資源利用教育部重點實驗室，遼寧 大連 116600；2.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

大菱鲆（Scophthalmus maximus）屬于鰈形目、鲆科、菱鲆屬，俗稱歐洲比目魚，在中國俗稱“多寶魚”，原產于歐洲大西洋海域，是世界公認的優質比目魚之一[1]。大菱鲆的肉質細嫩、鮮美，營養價值豐富，且其生長速度快、適應能力強。自從1992年被成功引入我國后，使我國鲆鰈類養殖業快速發展，成為了我國海水養殖魚類的支柱產業。目前，大菱鲆的養殖主要集中在山東、遼寧等北方地區，且其銷售半徑逐步擴大。但是由于大菱鲆水分和營養物質含量高，易腐敗變質，因此大菱鲆在貯運過程中的品質特性和質量安全日益引起人們的關注[2]。

鮮度是評價水產品品質的一個重要指標，水產品的價值大多取決于其鮮度[3]。水產品在貯藏過程中極易在微生物、酶及脂肪氧化等作用下發生腐敗變質，其鮮度變化與微生物生長、理化指標變化及蛋白質降解都有著密切關系[4]。盡管引起水產品腐敗變質的因素較多，但其最主要的原因是微生物的生長代謝[5]。在水產品腐敗變質過程中，不同微生物的致腐能力存在差異，其中只有部分微生物參與了腐敗過程，這些微生物被稱作特定腐敗菌（specific spoilage organisms，SSO）[6-7]。SSO在水產品貯藏過程中的生長速度較其他微生物快，且其致腐能力強[8]。有研究表明，在有氧冷藏過程中，來源于不同水域水產品的SSO多為假單胞菌（Pseudomonas spp.）或者腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens），而來自受污染水域水產品的SSO是腸細菌（Enterobactericeae）[9-10]。崔正翠等[11]發現腐敗希瓦氏菌和假單胞菌是冷藏大菱鲆的SSO。Nychas等[12]研究發現一些耐冷的腸桿菌，如蜂房哈夫尼亞菌（Hafnia alvei）、成團腸桿菌（Enterobacter agglomerans）、變形斑沙雷菌（Serratia proteamaculans）等，在肉及肉制品中數量不多，卻能夠引起其腐敗變質。因此，研究水產品腐敗菌在水產品腐敗變質中所起作用具有重要意義。

腐敗希瓦氏菌是一種嗜冷革蘭氏陰性菌，為運動桿菌，致腐潛力大，能夠將氧化三甲胺還原為三甲胺，并產生硫化氫，同時能夠降解一些含硫氨基酸產生揮發性硫化物，該菌在低溫貯藏魚類及其他產品腐敗過程中起到重要作用[13]。蜂房哈夫尼亞菌是革蘭氏陰性、運動性、有鞭毛的兼性厭氧桿菌，是細菌性食品污染菌，能夠造成富含蛋白質的乳制品、肉制品及水產品在低溫貯藏條件下的腐敗變質，同時也是一種條件性致病菌[14]。本實驗將從腐敗大菱鲆中分離得到的腐敗希瓦氏菌SP22及其與蜂房哈夫尼亞菌Ha-01的混合菌接種于大菱鲆無菌魚塊中，通過研究其在冷藏期間新鮮度相關指標（菌落總數、揮發性鹽基總氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值、K值、Ca2＋-ATPase活力及肌肉蛋白結構）的變化，來探究腐敗希瓦氏菌SP22對大菱鲆的致腐潛力，也為探討水產品優勢腐敗菌及共生菌的致腐機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

養殖大菱鲆購買于遼寧省錦州市水產市場，每條魚的質量為（850±50）g。

蜂房哈夫尼亞菌Ha-01、腐敗希瓦氏菌SP22均從腐敗大菱鲆中分離獲得，并由遼寧省食品安全重點實驗室保藏。菌株在溶菌（lysogeny broth，LB）肉湯培養基中28 ℃、160 r/min搖床過夜培養，備用。

平板計數瓊脂、LB營養瓊脂培養基、LB肉湯培養基青島海博生物技術有限公司；超微量Ca2＋-ATPase試劑盒南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋公司；HZQ-X300C型恒溫振蕩器、BPS-100CA恒溫恒濕培養箱上海一恒科技有限公司；MS105UD電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多有限公司；Biofuge Stratos冷凍高速離心機美國Thermo Fisher Scientific公司；BCM-1000A型生物潔凈工作臺 蘇州凈化過濾設備有限公司；Bag Mixer 400型拍打均質機 上海精宏實驗設備有限公司；全自動凱氏定氮儀 丹麥福斯公司；UV2550紫外-可見分光光度計杭州惠爾儀器設備有限公司；NMI20型核磁共振成像儀上海紐邁電子科技有限公司；S-4800場發射掃描電子顯微鏡日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 大菱鲆無菌魚塊的制備

參照Herbert[15]和李學英[16]等的方法制備大菱鲆無菌魚塊。將大菱鲆清洗后，無菌操作切取大菱鲆背部魚肉，去皮，用滅菌剪刀修剪魚塊至大小形狀一致（25～35 g/塊）后，無菌水清洗，然后用無菌濾紙擦拭魚塊表面水分，再用體積分數75%乙醇溶液擦拭魚塊，最后將制備好的魚塊放在酒精燈火焰周圍灼燒1～2 s。上述所有步驟均在無菌操作臺中完成。對制備好的大菱鲆無菌魚塊進行菌落總數測定，菌落總數小于102CFU/g即符合實驗要求。

1.3.2 腐敗希瓦氏菌SP22及其與蜂房哈夫尼亞菌Ha-01混合菌菌懸液制備及接種

分別挑取腐敗希瓦氏菌SP22及蜂房哈夫尼亞菌Ha-01，在LB營養瓊脂培養基上劃線，28 ℃過夜培養。再分別挑取二者的單菌落于滅菌LB肉湯培養基中28 ℃搖床過夜培養，取1 mL培養后的菌液10 000 r/min、1 min離心，棄去上清液，加生理鹽水溶解沉淀，利用比濁儀與麥氏比濁管測定并換算，將其數量調節至約108CFU/mL。再用無菌生理鹽水稀釋至106CFU/mL。二者的混合菌液由制備好的兩種菌液按體積比1∶1混合制得。然后將大菱鲆無菌魚塊浸入制備好的菌懸液中，約3～5 s后撈出瀝干。使用滅菌生理鹽水浸泡作為對照。將接種后的魚塊裝入無菌蒸煮袋中，密封包裝，置于4 ℃冰箱冷藏，連續7 d每天取樣測定其新鮮度指標變化。

1.3.3 冷藏大菱鲆魚塊的新鮮度指標測定

1.3.3.1 菌落總數的測定

菌落總數按照GB 4789.2—2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[17]采用平板傾注法進行測定。

1.3.3.2 TVB-N值的測定

TVB-N值參考FOSS應用子報《鮮魚和凍魚中揮發性鹽基氮（TVBN）的測定》[18]使用全自動凱氏定氮儀進行測定。

1.3.3.3 K值的測定

K值參考Li Tingting等[19]的方法稍作修改進行測定。稱取5 g絞碎的魚肉于燒杯中，加入25 mL 0.6 mol/L的高氯酸，充分勻漿后，3 000×g離心10 min，取上清液，用1 mol/L的NaOH溶液將其pH值調至6.5～6.8，靜置30 min后，3 000×g離心10 min，取上清液，置于－80 ℃貯藏備用。使用前用0.45 μm的水相濾膜過濾。K值按公式（1）計算。

式中：c（HXR）、c（HX）、c（ATP）、c（ADP）、c（AMP）、c（IMP）分別為次黃嘌呤核苷（inosine）、次黃嘌呤（hypoxanthine）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate）、腺苷酸（adenine nucleotides）、肌苷酸（inosine monphosphate）含量/（μmol/g）。

1.3.3.4 Ca2＋-ATPase活力的測定

Ca2＋-ATPase活力參照超微量Ca2＋-ATPase試劑盒的操作說明進行測定。

1.3.3.5 掃描電子顯微鏡觀察肌原纖維蛋白結構

取絞碎后的大菱鲆魚肉，加入5 倍體積的20 mmol/L的Tris-HCl溶液（pH 7.2），均質后5 000 r/min、10 min離心。取沉淀，加入5 倍體積的10 mmol/L Tris-HCl-NaCl溶液（pH 7.2），均質后5 000 r/min、10 min離心。取上清液，采用雙縮脲法測定蛋白液濃度。

參考劉焱[20]的方法稍作修改。首先將提取的魚肉蛋白質冷凍干燥后，放入4 ℃預冷的體積分數2.5%戊二醛溶液中浸泡24 h。使用pH 7.0磷酸鹽緩沖液漂洗3 次，10 min/次。取出后先分別放入體積分數50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液中浸泡2 次，10 min/次，再經醋酸異戊酯置換2 次，15 min/次，取出后放入冷凍干燥儀中干燥后磨成粉末。將樣品噴金后使用掃描電子顯微鏡進行觀察。

1.4 數據分析

采用Excel、SPSS 19.0及Origin 8.6軟件進行數據統計分析并繪圖，應用One-way ANOVA模型進行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 菌落總數的變化

圖1 大菱鲆4 ℃貯藏過程中菌落總數的變化Fig. 1 Total viable count changes of turbot during storage at 4 ℃

魚類所含營養物質豐富，具有高蛋白含量和高水分含量等特點，其中微生物的生長繁殖是導致魚體死后腐敗變質的主要誘因[21]。由圖1可知，在冷藏過程中3 組樣品的菌落總數均隨貯藏時間的延長而增加：其中接種腐敗希瓦氏菌SP22的實驗組在貯藏第7天時達到7.57（lg（CFU/g））；接種腐敗希瓦氏菌SP22與蜂房哈夫尼亞菌Ha-01的混合菌組樣品菌落總數在第6天時已經達到7.37（lg（CFU/g）），在貯藏第7天時達到8.30（lg（CFU/g））；而空白對照組在貯藏第7天時才達到4.95（lg（CFU/g））。根據國際微生物規格委員會食品微生物限量規定，魚類菌落總數的可接受水平限量為5.70（lg（CFU/g）），最高安全限量為7.00（lg（CFU/g））[22]。所以接種菌株腐敗希瓦氏菌SP22的樣品組在貯藏第7天時超過最高安全限量，達到腐敗，接種腐敗希瓦氏菌SP22和蜂房哈夫尼亞菌Ha-01混合菌的魚塊在第6天時已經達到腐敗終點，而空白對照組在貯藏第7天時還未超過可接受限量。說明腐敗希瓦氏菌SP22能夠加快大菱鲆無菌魚塊的腐敗變質，且當其與蜂房哈夫尼亞菌Ha-01共培養時致腐潛力更大。張旭東等[23]的研究也表明，蜂房哈夫尼亞菌能夠加快冷藏牛肉的腐敗，這與本實驗的研究結果一致。

2.2 TVB-N值的變化

圖2 大菱鲆4 ℃貯藏過程中TVB-N值的變化Fig. 2 Change in TVB-N value of turbot fillets during storage at 4 ℃

在水產品貯藏中，TVB-N是蛋白質在細菌和酶的共同作用下分解產生的氨及胺類等堿性含氮物質，能夠有效表征水產品的品質變化[24]。由圖2可知，接種腐敗希瓦氏菌SP22及其與蜂房哈夫尼亞菌Ha-01混合菌的魚塊在冷藏期間TVB-N值增長速度明顯快于空白對照組（P＜0.05）。其中，接種腐敗希瓦氏菌SP22的魚塊在第6天時TVB-N值達到35.33 mg/100 g；接種混合菌株的魚塊在第5天時TVB-N值達到36.31 mg/100 g；而空白對照組的無菌魚塊在第7天時TVB-N值才達到26.31 mg/100 g。根據GB/T 5009.45—2003《水產品衛生標準的分析方法》[25]中規定：海水魚TVB-N值低于13 mg/100 g時為一級鮮度；超過30 mg/100 g時即不可食用。因此接種腐敗希瓦氏菌SP22的魚塊在第6天時已經腐敗，而接種混合菌株的魚塊在第5天時已經腐敗，這與菌落總數的測定結果基本一致。

2.3 K值的變化

一般認為，魚體死亡后，其肌肉內的ATP會降解為ADP、AMP、IMP、HXR及HX。K值即HXR與HX占ATP及其相關物質總量的百分比[26]，能夠較好地反映水產品在貯藏期間的新鮮度變化，K值越小表明其新鮮度越好。一般認為即殺魚K值≤10%，當K值≤20%時可作為生魚片的原料，在20%～40%范圍內為一級鮮度，在40%～60%范圍內為二級鮮度，在60%～80%范圍則為初期腐敗[27]。

由圖3可知，大菱鲆無菌魚塊初始K值為5.54%，品質較高，在4 ℃條件下貯藏時，K值隨著貯藏時間的延長呈現上升趨勢，且接菌組K值變化明顯快于空白對照組（P＜0.05）。其中，接種腐敗希瓦氏菌SP22的魚塊K值在第6天時為66.73%，已經達到初期腐敗，而接種混合菌組的魚塊在第5天時已經達到68.85%，表明魚塊為初期腐敗。

圖3 大菱鲆4 ℃貯藏過程中K值的變化Fig. 3 Change in K value of turbot fillets during storage at 4 ℃

2.4 Ca2＋-ATPase活力的變化

肌原纖維蛋白的主要組成成分是肌球蛋白，ATPase活性源于其球狀結構頭部，在冷藏過程中肌球蛋白發生變性時，ATPase活性也隨之變化，直至失去活性[28]。因此可以用Ca2＋-ATPase活性作為評價蛋白質品質的指標，繼而反映肌肉的變化情況[29]。

由圖4所示可知，各實驗組的Ca2＋-ATPase活力在整個貯藏期間呈下降趨勢，且接菌組下降速度明顯快于空白對照組（P＜0.05）。其中接種腐敗希瓦氏菌SP22以及接種其與蜂房哈夫尼亞菌Ha-01混合菌的魚塊在貯藏前3 d時Ca2＋-ATPase活力變化情況基本一致，而從第4天開始，接種混合菌的魚塊下降速度明顯快于接種腐敗希瓦氏菌SP22單菌組，說明腐敗希瓦氏菌可以影響大菱鲆無菌魚塊Ca2＋-ATPase活力的變化及其蛋白質的變性，且蜂房哈夫尼亞菌的存在能夠加速腐敗。

2.5 肌原纖維蛋白顯微結構的變化

圖4 大菱鲆4 ℃貯藏過程中Ca2＋-ATPase活力的變化Fig. 4 Change in Ca2+-ATPase activity of turbot fillets during storage at 4 ℃

從圖5可以看出，在第0天時各組的肌肉蛋白質顆粒結構完整，表面平滑，隨著貯藏時間的延長，蛋白質結構表面逐漸出現孔隙和碎片化。其中，空白對照組在第5天時蛋白質表面才開始出現溝壑，第7天時出現較為明顯的斷裂。接種腐敗希瓦氏菌SP22的魚塊從第4天開始，蛋白質出現較大孔穴，此后蛋白質繼續降解、變性。而接種腐敗希瓦氏菌SP22與蜂房哈夫尼亞菌Ha-01混合菌的實驗組，在冷藏過程中蛋白質破碎速度更快，在貯藏第1天時蛋白質結構已經出現明顯扭曲，然后蛋白質逐漸斷裂，第3天開始出現較大孔穴，第5天破碎現象已經較為嚴重。根據王發祥等[30]研究的草魚肌肉蛋白變化結果可知，在貯藏過程中，蛋白質能夠受到組織酶的影響而發生水解，使蛋白質不斷地降解變性，最終出現小片化。由此說明，接種大菱鲆SSO能夠加快魚肉蛋白質的降解變性速度。

圖5 大菱鲆4 ℃貯藏過程中肌肉蛋白質的掃描電子顯微鏡圖Fig. 5 Scanning electron microscope images of turbot muscle proteins during storage at 4 ℃

3 結 論

通過對大菱鲆無菌魚塊菌落總數、TVB-N值、K值、Ca2＋-ATPase活力及肌肉蛋白的顯微結構等指標進行分析，比較了腐敗希瓦氏菌SP22以及其與蜂房哈夫尼亞菌Ha-01混合菌對大菱鲆無菌魚塊的致腐潛力。結果表明：與空白對照組的大菱鲆無菌魚塊相比，接種腐敗希瓦氏菌SP22單菌組及混合菌組的魚塊的菌落總數、TVB-N值、K值、Ca2＋-ATPase活力及肌肉蛋白的顯微結構變化速度均快于空白對照組，且接種混合菌組的魚塊腐敗速度更快，這說明接種腐敗希瓦氏菌SP22及其與蜂房哈夫尼亞菌Ha-01的混合菌均能夠引起大菱鲆的腐敗變質，且二者混合時腐敗速度更快。因此，腐敗希瓦氏菌SP22具有較強的致腐潛力，且在營養物質豐富的情況下其能夠與蜂房哈夫尼亞菌Ha-01產生共生作用，從而加速大菱鲆魚肉的腐敗變質。