蘿卜籽蛋白提取物對鱘魚腐敗菌抑制作用及其理化性質的研究

李 軍，李平蘭，王 順，高 亮，桂 萌,

（1.北京市水產科學研究所，北京 100071；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京 100083）

鱘魚是我國重要的經濟淡水魚，其產量已達到世界總產量的80%左右。魚類產品具有高水分、高蛋白的特點，極易滋生微生物而腐敗變質，不僅造成了極大的經濟損失，同時也為魚類及其產品的流通、貯藏和銷售帶來不便。目前水產品保鮮技術主要為冷凍保鮮、化學保鮮及氣調保鮮等，但以上方法存在蛋白質變性、營養成分流失和化學品殘留等問題[1-6]，因此針對鱘魚及其加工制品安全、高效防腐技術的研發成為目前亟待解決的問題。

水產品的腐敗主要由微生物引起，因此可以通過抑制微生物的活性延緩或阻止其生長，從而對水產品進行防腐保鮮。添加防腐劑是一種方便、有效的食品防腐方法[7-8]。抗菌蛋白（抗菌肽）是植物體內一類重要的活性成分，是生物天然免疫防御系統的重要組成部分。抗菌蛋白具有抗菌譜廣、高效、環保、不使病原菌產生耐藥性等優點，目前正成為水產品新型防腐劑開發的研究熱點[9-15]。不同的植物可以產生不同的抗菌蛋白，目前對于多數植物抗菌蛋白抑菌特性的研究都集中于病原菌。Mandal等[16]從椰子汁中提取了3 種抗菌蛋白，它們對大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）具有一定的抑制作用。Wong等[17]從青豆中提取了一種抗菌肽，它對灰霉菌（Botrytis cinerea）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和花生褐斑病菌（Mycosphaerella arachidicola）具有抑制作用。吳海霞[18]利用磷酸鹽緩沖液從銀杏種仁中提取得到抗菌肽，發現其對青霉菌（Penicillium）、產紫青霉（P. purpurogenum）、沙門柏干酪青霉（P. camemberti）和黑曲霉（Aspergillus niger）具有不同程度的抑制作用。付穎穎[19]對苦瓜蛋白進行了研究，結果表明苦瓜蛋白對啤酒酵母、紅酵母、黃曲霉和黑曲霉具有很強的抑制作用，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌也具有一定的抑制作用。魚類腐敗菌主要包括氣單胞菌（Aeromonas）、腸桿菌（Enterobacteriaceae）、假單胞菌（Pseudomonas）和希瓦氏菌（Shewanella）等[20-22]，然而目前尚鮮有針對魚類腐敗菌的植物抗菌蛋白的研究。

植物種子的蛋白含量高、成分復雜，多種植物種子蛋白具有抑菌活性，如苦豆子種子、苦瓜種子、銀杏種子等[18-19]。根據目前的文獻報道，植物種子抗菌蛋白理化性質比較穩定，一般易溶于水或有機溶劑，對熱處理和酸堿變化穩定，且不易被消化酶水解[18-19,23-26]。銀杏種仁抗菌蛋白對pH值、熱及NaCl溶液較為穩定[18]；苦瓜蛋白對紫外線照射穩定，在偏酸性和中性及質量濃度低于0.8 mg/mL的NaCl溶液條件下抑菌效果較好[19]。白蘿卜是一種具有極高營養價值的蔬菜，同時也具有促進消化、增強食欲、加快胃腸蠕動和止咳化痰的作用，在臨床中具有一定的藥用價值[27-28]。蘿卜抗菌蛋白對多種植物病原菌的抑菌活性已得到廣泛驗證[29-30]，而蘿卜種子蛋白對魚類腐敗菌的抑菌特性及其理化性質的研究還鮮見報道。

本研究采用硫酸銨沉淀法從白蘿卜籽中提取蛋白，研究了其對來源于冷藏鱘魚的28 株腐敗菌的抑菌作用，同時研究了該蛋白提取物的理化性質。本研究為蘿卜籽蛋白提取物作為新型鱘魚防腐劑的開發和其在水產品防腐保鮮方面的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌（E. coli）DH5α（指示菌）購于天根生化科技有限公司。受試菌分離于4 ℃冷藏的真空包裝和托盤包裝腐敗鱘魚肉，具體菌種見表1。

LB液體培養基（每升培養基）：酵母膏5 g、蛋白胨10 g和NaCl 10 g。LB固體培養基（每升培養基）：在LB液體培養基的基礎上添加17 g瓊脂粉。營養肉湯培養基（每升培養基）：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g和NaCl 5 g。營養肉湯固體培養基：在營養肉湯培養基的基礎上添加17 g/L瓊脂粉。

十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶 美國Sigma公司；中性蛋白酶 北京奧博星生物技術有限公司；KCl、CaCl2、NaCl、MgCl2、FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、AlCl3·6H2O、LiCl·H2O、CoCl2·6H2O、NiCl2·6H2O、PbCl2、MnSO4·H2O、AgNO3、吐溫20、吐溫-80、司班80 國藥集團化學試劑有限公司；NaOH、HCl 北京化工廠；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA） 索萊寶生物科技有限公司；β-巰基乙醇 Amerson（中國）有限公司；Bradford蛋白質定量試劑盒 天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MP5002電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；冷凍離心機 美國Sigma公司；HWS2型電熱恒溫水浴鍋、LRH生化培養箱 上海一恒科技儀器有限公司；凱氏定氮儀 濟南阿爾瓦儀器有限公司；HDL潔凈工作臺 北京東聯哈爾儀器有限公司；微波爐 廣州美的廚房電器制造有限公司；雷磁PHS-3C型pH計上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘿卜籽蛋白的提取及蛋白質量濃度的測定

將白蘿卜籽粉碎后與1.5% EDTA緩沖液以料液比1∶5浸泡12 h。8 層紗布過濾后所得溶液12 000 r/min離心5 min，收集上清液，邊攪拌邊添加質量分數80%的硫酸銨，沉淀3 h，12 000 r/min離心20 min，收集沉淀，用去離子水復溶，12 000 r/min離心20 min，上清液即為所需蛋白溶液。將蛋白溶液稀釋100 倍，采用Bradford蛋白質定量試劑盒（測定范圍為50～1 000 μg/mL）測定溶液中蛋白的質量濃度。

1.3.2 蘿卜籽蛋白提取物對鱘魚腐敗菌的抑制作用

選取8 株氣單胞菌、7 株假單胞菌、11 株腸桿菌和2 株其他菌屬的菌株進行抑菌實驗。將28 株鱘魚腐敗菌總數稀釋至106CFU/mL，采用牛津杯法進行抑菌實驗，吸取1 mL菌液于培養皿中，加入10 mL融化的營養肉湯瓊脂培養基進行混合，待培養基凝固后，在培養皿中心放置滅菌烘干的牛津杯（外徑8 mm、內徑6 mm、高10 mm），用移液槍加入200 μL蛋白溶液，37 ℃培養24 h后量取抑菌圈直徑。每個處理組重復3 次。

1.3.3 溫度對蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

取一定質量濃度的蛋白溶液，分別在0、4、25、60、70、80、90、100 ℃水浴30 min。吸取200 μL蛋白溶液，以DH5α為指示菌進行牛津杯法抑菌實驗，以未處理的蛋白溶液作為對照，37 ℃培養24 h后量取抑菌圈直徑，每個樣品重復3 次。相對抑菌活力按公式（1）計算。

1.3.4 pH值對蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

取一定質量濃度的蛋白溶液，用1 mol/L NaOH和HCl溶液將其pH值分別調至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，37 ℃水浴2 h后將pH值調至7.0，取200 μL酸、堿處理過的蛋白溶液，以DH5α為指示菌進行牛津杯法抑菌實驗，以未處理的蛋白溶液作為對照，37 ℃培養24 h后量取抑菌圈直徑，每個樣品重復3 次。相對抑菌活力按公式（1）計算。

1.3.5 紫外線照射時間對蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

取一定質量濃度的蛋白溶液在40 W紫外燈下分別照射（照射距離20 cm）2、4、6、8、10、12 h和24 h。取200 μL處理過的蛋白溶液，以DH5α為指示菌進行牛津杯法抑菌實驗，以未處理的蛋白溶液作為對照，37 ℃培養24 h后量取抑菌圈直徑，每個樣品重復3 次。相對抑菌活力按公式（1）計算。

1.3.6 金屬離子對蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

將K＋、Ca2＋、Na＋、Mg2＋、Fe2＋、Zn2＋、Cu2＋、Al3＋、Li＋、Co2＋、Ni2＋、Pb2＋、Mn2＋和Ag＋添加到一定質量濃度的蛋白溶液中，使金屬離子在溶液中的終濃度分別為10、50 mmol/L和90 mmol/L，37 ℃水浴2 h。取200 μL處理過的蛋白溶液，以DH5α為指示菌進行牛津杯法抑菌實驗，以未處理的蛋白溶液作為對照，37 ℃培養24 h后量取抑菌圈直徑，每個樣品重復3 次。相對抑菌活力按公式（1）計算。

1.3.7 表面活性劑對蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

選取SDS、EDTA、尿素、吐溫20、吐溫-80和司班80 6 種表面活性劑。將6 種表面活性劑添加到一定質量濃度的蛋白溶液中，使表面活性劑的終質量分數分別為1%、5%和10%，37 ℃水浴2 h。取200 μL處理過的蛋白溶液，以DH5α為指示菌進行牛津杯法抑菌實驗，以未處理的蛋白溶液作為對照，37 ℃培養24 h后量取抑菌圈直徑，每個樣品重復3 次。相對抑菌活力按公式（1）計算。

1.3.8 蛋白酶對蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

選取胰蛋白酶、中性蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶4 種蛋白酶，將這4 種蛋白酶分別添加到一定質量濃度的蛋白溶液中，使酶的終質量濃度分別為l、5 mg/mL和9 mg/mL，37 ℃處理2 h。取200 μL處理過的蛋白溶液，以DH5α為指示菌進行牛津杯法抑菌實驗，以未處理的蛋白溶液作為對照，37 ℃培養24 h后量取抑菌圈直徑，每個樣品重復3 次。相對抑菌活力按公式（1）計算。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 蘿卜籽蛋白提取物中蛋白質量濃度

采用經典的Bradford法測定蛋白溶液中蛋白的質量濃度[31]。蘿卜籽蛋白提取物溶液中蛋白質量濃度的標準曲線為y＝0.360 6x＋0.351 8（R2＝0.991 8）。經過該方法測定，蘿卜籽蛋白提取物溶液中蛋白質量濃度為44.56 mg/mL。

2.2 蘿卜籽蛋白提取物對鱘魚腐敗菌的抑制作用

微生物是導致食品腐敗的主要原因，因此抑制微生物的生長可以有效地對食品腐敗進行控制。蘿卜籽抗菌蛋白對28 株鱘魚腐敗菌的抑制作用如表1所示。抗菌蛋白對所有受試菌株均具有良好的抑制作用。目前對植物源抗菌蛋白的研究多集中于其對真菌的抑制作用，對細菌抑菌作用的研究較少[18,32-33]。本實驗中的氣單胞菌、腸桿菌和假單胞菌是水產品中常見的腐敗菌[20-22]。結果表明，蘿卜籽蛋白提取物對水產品腐敗菌具有廣泛的抑制作用，具有應用于水產品防腐的潛力。

表1 蘿卜籽蛋白提取物的抑菌作用Table1 Antimicrobial spectrum of radish seed protein extract

2.3 溫度對蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

熱處理是導致蛋白質變性的一個主要原因。其原理是高溫促進原子和基團的熱運動，從而使得穩定蛋白質分子結構的各種因素減弱、肽鏈松散，使蛋白體系的穩定性降低，可溶解的蛋白含量減少，從而發生蛋白質的變性[34]。

表2 溫度對蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響Table2 Effect of temperature on bacteriostatic activity of radish seed protein extract

從表2中可以看出，蘿卜籽蛋白提取物在0～80 ℃處理條件下其抑菌圈直徑不同程度的減小，但相對抑菌活力仍大于79.00%。這說明抗菌蛋白在低于80 ℃條件下熱穩定性較好；溫度高于80 ℃時，隨著熱處理溫度的提高，蛋白提取物的抑菌圈直徑急劇減小，當溫度達到100 ℃時，蛋白提取物相對抑菌活力僅為22.99%。銀杏種仁抗菌蛋白高于60 ℃處理即發生顯著變性（幾乎無抑菌活力），苦瓜抗菌蛋白在64 ℃處理后隨著溫度的上升抑菌活力呈加速下降趨勢（相對抑菌活力小于70%）[18-19]。本研究中蘿卜籽蛋白提取物對溫度的穩定性要優于銀杏種仁抗菌蛋白和苦瓜抗菌蛋白。

2.4 pH值對蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

表3 pH值對蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響Table3 Effect of pH on bacteriostatic activity of radish seed protein extract

蛋白質在其等電點附近易發生絮凝，導致可溶性蛋白減少，蛋白質的生物活性下降。大多數植物源抗菌蛋白的等電點大于7，銀杏種仁抗菌蛋白和苦瓜抗菌蛋白的等電點分別為8.5和9.6[18-19]。從表3中可以看出，在pH 2.0～8.0范圍內蘿卜籽蛋白提取物的相對抑菌活力大于72.00%，說明該蛋白提取物在酸性和偏中性的環境中穩定。在pH值大于8.0時，蛋白提取物的相對抑菌活力快速下降，可以推斷蘿卜籽蛋白提取物等電點在8.0～9.0之間。

2.5 紫外線照射時間對蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

有研究報道苦瓜抗菌蛋白對紫外線處理穩定性較強，芽孢桿菌抗菌脂肽經3 h紫外線照射后抑菌活力沒有變化[19,35]。從表4中可以看出，紫外線照射0～24 h，蛋白提取物的抑菌活力仍較好（相對抑菌活力大于94.00%）。這說明紫外線照射時間對該蛋白提取物的抑菌活力沒有影響。

表4 紫外線照射對蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響Table4 Effect of ultraviolet irradiation on bacteriostatic activity of radish seed protein extract

2.6 金屬離子對蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

不同種類、不同濃度的金屬離子均會對蛋白質的穩定性產生影響，金屬離子對魚精蛋白的抑菌活力有抑制作用，且電荷數和濃度越高影響越大（Ca2＋＞Mg2＋＞K＋＞Na＋）[36]。從表5中可以看出，當Ag＋濃度為50 mmol/L和90 mmol/L時，蛋白提取物的相對抑菌活力下降了約70%，這說明Ag＋對蛋白提取物的抑菌活力有顯著的抑制作用；除Ag＋外，其他13 種金屬離子對蛋白提取物相對抑菌活力無明顯抑制效果（相對抑菌活力大于90.00%）。金屬離子濃度在90 mmol/L時，Ni2＋、Cu2＋和Co2＋均可在一定程度上增強蘿卜籽蛋白提取物的抑菌活力（相對抑菌活力大于110.00%）。

表5 金屬離子對蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響Table5 Effect of metal irons on bacteriostatic activity of radish seed protein extract

2.7 表面活性劑對蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

食品生產過程中會經常使用一些表面活性劑作為乳化劑，如吐溫-80和吐溫20等，因此蛋白提取物對表面活性劑的穩定性可用于評估其在食品加工過程中的穩定性。如表6所示，蘿卜籽蛋白提取物的抑菌活力因SDS質量分數的增加而顯著減弱（P＜0.05），說明該蛋白提取物對SDS穩定性較差。不同質量分數的尿素、吐溫20和司班80處理后蛋白提取物相對抑菌活力均大于90.00%，說明該蛋白提取物對尿素、吐溫20和司班80穩定性較好。此外，增大EDTA質量分數可以顯著增強蛋白提取物的抑菌活力（P＜0.05）。

表6 表面活性劑對蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響Table6 Effect of surfactants on bacteriostatic activity of radish seed protein extract

2.8 蛋白酶對蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

如表7所示，蘿卜籽蛋白提取物經4 種蛋白酶在不同質量濃度分別處理后相對抑菌活力均大于96.00%，說明其對這4 種蛋白酶的穩定性較好，這可能是由于蘿卜籽蛋白的空間構象使蛋白酶不易找到酶切位點[35]。不同來源的抗菌蛋白對蛋白酶的敏感性不同，芽孢桿菌分泌的抗菌脂肽bacillomycin L對蛋白酶基本保持穩定，芽孢抗菌脂肽經1 mg/mL胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和中性蛋白酶處理2 h后的相對抑菌活力分別為94.86%、86.21%、96.73%和98.89%[35]。而格氏乳球菌的抗菌蛋白garviecin LG 34極易被蛋白酶水解，該抗菌蛋白分別經5 mg/mL木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后完全失去抑菌活力[37]。

表7 不同蛋白酶對蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響Table7 Effect of proteases on bacteriostatic activity of radish seed protein extract

3 結 論

蘿卜籽蛋白提取物對來源于鱘魚的28 株腐敗菌均具有抑制作用：蘿卜籽蛋白提取物對溫度、酸處理、紫外線穩定性較好；對胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和中性蛋白酶均具有較好的穩定性（相對抑菌活力大于96.00%）；對Ag＋敏感，而對Pb3＋、Mg2＋、Li＋等13 種金屬離子穩定性較好；對尿素、吐溫20和司班80穩定性較好，一定質量分數的EDTA可增強其抑菌活力。以上結果表明蘿卜籽蛋白提取物對鱘魚腐敗菌具有廣泛的抑制作用且理化性質穩定，具有開發成新型鱘魚及相關水產品防腐保鮮劑的潛在價值。