大豆自然老化時間對豆漿理化特性及風味品質的影響

吳永慶，張華江，遲厚裕，夏 寧，徐麗娜，劉媛媛，李 彤

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆自然老化是指成熟后的大豆籽粒在室溫環境下放置的過程中，其蛋白質、脂肪、糖類及其他營養成分含量降低且活力下降，甚至出現活力完全喪失或死亡的變化過程，同時也是一種隨著大豆貯藏時間的延長而發生的自然不可逆的過程[1]。大豆從收獲到制成豆制品要經過一系列運輸、貯藏和加工的過程，而在這一系列過程中會造成大豆不同程度的老化。我國的主要大豆種植區在東北地區，而大豆加工企業多分布在東南沿海省份，大豆相關產品的消費也主要集中在東南沿海地區[2]，大豆在由東北地區運輸到東南沿海地區的過程中，貯藏環境和時間的不同對大豆的物理化學性質有著不同程度的影響。豆漿是我國傳統的綠色營養早餐飲品，富含多種人體所需的營養成分，屬于一種營養豐富且具有一定保健作用的蛋白飲料。豆漿不僅富含優質蛋白質、不飽和脂肪酸、維生素和礦物質等多種營養成分，而且含有異黃酮、大豆皂苷、大豆低聚糖和卵磷脂等具有保健功能的特殊保健因子，因此深受廣大人民的喜愛[3-5]。我國喜歡喝豆漿的人數眾多，對豆漿的需求量也較大，因此人們對豆漿的營養價值越來越重視。我國豆漿市場的前景非常廣闊，因而對豆漿的研究具有重要的現實意義。

如今豆漿加工廠的制漿工藝逐漸趨于成熟，但是市場上豆漿的品質卻參差不齊，即使是同一廠家的豆漿，各批次的品質也有很大差異，其原因可能與大豆的貯藏時間有關，老化會使大豆種子的脂肪酸、粗蛋白和可溶性糖含量出現不同程度的下降[6]。田茜[7]的研究發現，大豆老化破壞了大豆胚軸線粒體的完整性。吳聚蘭等[8]對晉豆19號進行40 ℃、相對濕度100%老化處理，發現人工老化的大豆發芽指標與粗脂肪含量成正相關，與粗蛋白含量成負相關。高華偉等[9]的研究發現自然老化的大豆發芽率高于人工老化。Kamizake等[10]的研究發現：自然老化和人工加速老化后，大豆籽粒的柵欄細胞變皺，籽粒顏色加深，蒸煮后硬度增加，蛋白質、脂肪含量下降；大豆老化后植酸含量無變化，酚類化合物和酸度增加。Kamizake等[11]還發現隨著老化時間的延長，豆腐的產量降低。Hou等[12]的研究發現，大豆在30 ℃、相對濕度84%條件下貯藏9 個月后，可溶性總糖含量下降40%。Locher等[13]的研究發現，大豆在30 ℃、相對濕度82%條件下貯藏后低聚糖含量顯著下降。Thomas等[14]將大豆在20 ℃、相對濕度65%條件下貯藏8 個月后發現，豆漿的蛋白質提取率下降了14%。大豆從收獲到加工成豆制品往往需要經過一系列的運輸與貯藏，這期間發生的老化影響著豆制品的品質，因此自然老化對豆漿品質的影響是豆制品行業中亟待研究的課題。目前的報道多是關于老化對大豆品質的影響，而忽略了其對豆漿品質的影響。迄今關于自然老化對豆漿綜合品質，包括營養物質含量、穩定性、沉淀性及風味物質的影響尚鮮見報道。因此，本研究系統全面地研究了大豆不同自然老化時間對豆漿理化特性及風味品質的影響，對進一步改善豆漿綜合品質有理論和實踐指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東農42（收獲1 個月）由東北農業大學大豆研究所提供。2-甲基-3-庚酮（純度在99%以上） 美國Sigma Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

B-324全自動凱氏定氮儀 瑞士步琪實驗儀器公司；Zetasizer Nano ZS 90型納米粒徑電位分析儀 英國馬爾文公司；頂空-固相微萃取（headspace solidphase microextraction，HS-SPME）攪拌加熱裝置、PDMS/CAR/DVB萃取頭 美國Supelco公司；6890/5975B氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆自然老化

大豆自然老化實驗設計參考Kamizake等[10]的方法，并進行一定的修改。大豆置于自然老化環境（17～25 ℃，相對濕度49%～80%）下，老化時間為12 個月，期間每隔2 個月取一定量樣品制漿，用于豆漿品質（蛋白質、脂肪、可溶性固形物含量、風味物質的種類和含量）的分析。以在20 ℃、相對濕度47%的恒溫恒濕環境下平衡10 h的大豆為對照組并制備豆漿進行相應分析。

1.3.2 豆漿的制備

準確稱取一定質量的大豆，自來水洗滌3 次除去沙粒等雜物，蒸餾水洗2 次，按料液比1∶3在室溫下浸泡12 h，除去多余水分，以料液比1∶7用豆漿機磨漿，冷卻，80 目濾網過濾取漿，95 ℃保持5 min得豆漿。為減少樣品造成的實驗差異，同一批實驗處理所用豆漿為同次制備。

1.3.3 豆漿蛋白質、脂肪及可溶性固形物含量測定

蛋白質含量參照GB 5009.5—2010《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》[15]中凱氏定氮法進行測定，蛋白質分析系數為6.25。脂肪含量嚴格按照GB 5413.3—2010《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中脂肪的測定》[16]方法測定，測定3 次求平均值。可溶性固形物含量采用手持折光儀測定，測定3 次取平均值。

1.3.4 蛋白質提取率的測定

大豆和豆漿的蛋白質含量測定方法見1.3.3節，蛋白質提取率按公式（1）計算。

1.3.5 豆漿穩定性的測定

取適量豆漿樣液，用蒸餾水稀釋50 倍，取一部分稀釋后樣液于4 000 r/min離心5 min，在785 nm波長處用分光光度計分別測定豆漿離心前后的吸光度，豆漿的穩定系數按公式（2）[17]計算，以此表征豆漿穩定性。

式中：R為穩定系數，R≤1.00，R值越大表明豆漿體系越穩定；A后為離心后上清液吸光度；A前為離心前樣品吸光度。

1.3.6 豆漿沉淀性的測定

1.4 觀察30 d死亡事件 對入選患者進行門診和電話隨訪，觀察患者30 d內死亡事件的發生情況。1.5 統計學處理 應用SPSS 25.0軟件進行統計分析。對計量資料以x±s表示，組間比較采用獨立樣本 t檢驗，若方差不齊采用校正 t檢驗。用MedCalc軟件計算受試者工作特征（ROC）曲線，用曲線下面積（AUC）表示各評分的預測價值，AUC比較采用Z檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

在己知質量（m1/g）的離心管中加入已知質量（m0/g）的樣品，4 000 r/min離心15 min，棄去上層液體，倒扣試管瀝干10 min后稱質量（m2/g），按式（3）計算沉淀率，以此表征沉淀性。

1.3.7 豆漿粒徑的測定

采用Zetasizer Nano ZS 90型納米粒徑電位分析儀對不同樣品進行測定，每種樣品平行測定3 次，得到粒徑分布曲線。

1.3.8 豆漿風味物質的測定

HS-SPME條件[18]：取5 mL樣品置于10 mL萃取瓶中，放入轉子，再加入1 μL的內標物（2-甲基-3-庚酮），將老化的固相微萃取針插入樣品瓶，40 ℃水浴鍋平衡30 min后，邊攪拌邊頂空吸附，萃取溫度40 ℃，萃取時間30 min，攪拌速率600 r/min。

GC條件：采用DB-5 MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。升溫程序：起始溫度40 ℃，保持4 min；然后以6 ℃/min升溫至100 ℃；再以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持7 min；不分流進樣。MS條件：電子轟擊離子源，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，電子能量70 eV，掃描范圍m/z 40～400。

在利用NIST 2011質譜檢索庫檢索的基礎上，選擇匹配度大于80%的鑒定結果，同時運用峰面積歸一化法加2-甲基-3-庚酮作為內標定量，確定豆漿風味物質的種類和質量濃度。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 大豆自然老化時間對豆漿可溶性固形物和脂肪含量的影響

圖1 大豆自然老化時間對豆漿可溶性固形物（A）和脂肪含量（B）的影響Fig. 1 Effect of soybean natural aging time on the contents of soluble solid (A) and fat (B) in soybean milk

由圖1A可知，隨著大豆自然老化時間的延長，豆漿中可溶性固形物含量呈現逐漸下降的趨勢。而自然老化超過8 個月后，可溶性固形物含量曲線趨于平穩，無明顯下降趨勢，說明豆漿可溶性固形物含量基本穩定。對照組豆漿中可溶性固形物含量最高，為6.50 g/100 g，自然老化4、6、8、10 個月后，可溶性固形物含量分別為6.47、6.43、6.33、6.32 g/100 g，下降幅度分別為0.46%、1.07%、2.60%、2.77%；可明顯看出，自然老化8 個月與6 個月相比可溶性固形物含量下降幅度較大，為1.53%。這是由于自然老化會導致大豆硬度增加[6]，浸泡膨脹度降低，而在大豆磨漿時由于其膨脹度不夠，使留在豆渣中的可溶性固形物增多，導致豆漿中的可溶性固形物含量下降[19]。

脂肪含量的變化趨勢與可溶性固形物相似，均隨著大豆自然老化時間的延長而下降。由圖1B可知，對照組的脂肪含量為0.58 g/100 g，自然老化4、6、8、10 個月后，脂肪含量分別為0.57、0.55、0.51、0.50 g/100 g，下降幅度分別為1.72%、5.17%、12.09%、12.28%，可明顯看出自然老化6～8 個月期間脂肪含量下降幅度最大，為6.92%。這是由于大豆自然老化期間，環境對大豆表皮持續作用，使部分膜磷脂損壞從而引起脂質的水解和氧化反應，導致脂肪含量降低[20]。同時，大豆在貯藏期間部分蛋白質變性使大豆的網絡結構改變，這種網絡結構不益于細胞器的流動，導致制漿時脂肪的提取率降低[21]。

2.2 大豆自然老化時間對豆漿蛋白質含量及其提取率的影響

圖2 大豆自然老化時間對豆漿蛋白質含量（A）及其提取率（B）的影響Fig. 2 Effect of soybean natural aging time on the content (A) and extraction rate of protein (B) in soybean milk

由圖2A可知，隨著大豆自然老化時間的延長，蛋白質含量呈現逐漸下降趨勢，而自然老化時間超過8 個月后，蛋白質含量曲線趨于平穩，無明顯下降趨勢，表明蛋白質含量基本穩定。對照組的蛋白質含量為3.61 g/100 g，自然老化4、6、8、10 個月后，蛋白質含量分別為3.57、3.50、3.32、3.28 g/100 g，下降幅度分別為1.10%、3.05%、4.75%、5.41%，可以看出自然老化6～8 個月期間蛋白質下降幅度最大，為1.70%，這與可溶性固形物和脂肪含量的變化情況相仿。隨著自然老化時間的不斷延長，蛋白質、脂肪和可溶性固形物含量均有不同程度的減少，這與Kong Fanbin[19]、Kamizake[21]和Thomas[14]等的研究結果一致。這是由于大豆在自然老化期間，溫度和相對濕度長時間持續作用于大豆籽粒，破壞了細胞內區室，繼而引起一系列化學反應，包括蛋白質的變性聚集，造成了豆漿中蛋白質含量的降低[21]。

豆漿的蛋白質提取率是反映大豆籽粒蛋白質利用程度的重要指標，而在自然老化時間超過8 個月后，蛋白質提取率曲線逐漸趨于平穩，無明顯的下降趨勢，說明豆漿的蛋白質提取率基本穩定。由圖2B可知，隨著大豆自然老化時間的延長，蛋白質提取率呈現逐漸下降的趨勢。對照組的蛋白質提取率為81.69%，自然老化4、6、8、10 個月后，蛋白質提取率分別為81.30%、81.05%、80.42%、80.33%，下降幅度分別為0.48%、0.78%、1.55%、1.66%。Hou等[22]的研究發現，大豆在貯藏期間β-折疊結構含量減少，α-螺旋結構含量增加，但是蛋白質的分子質量沒有變化，這表明貯藏期間蛋白質變的更加聚集，從而使磨漿時蛋白質的溶出率下降，這可能是引起豆漿蛋白質提取率降低的原因之一。由圖1、2可知，大豆自然老化6～8 個月期間可溶性固形物、脂肪和蛋白質含量及蛋白質提取率下降幅度最大，因此，大豆貯藏時間為6 個月以內時，其主要營養成分含量可以維持在較高水平。

2.3 大豆自然老化時間對豆漿穩定性和沉淀性的影響

圖3 大豆自然老化時間對豆漿穩定性（A）及沉淀性（B）的影響Fig. 3 Effect of soybean natural aging time on the stability (A) and precipitability (B) of soybean milk

由圖3A可知，隨著大豆自然老化時間的不斷延長，豆漿的穩定系數逐漸減小。自然老化超過8 個月后，豆漿的穩定系數下降幅度也逐漸減小，這說明豆漿漸漸趨于穩定。自然老化4、6、8、10 個月后，豆漿的穩定系數分別為0.77、0.74、0.70、0.69，與對照組相比（穩定系數為0.78）其下降幅度分別為1.28%、5.13%、10.26%、11.54%。造成豆漿穩定性下降的原因是大豆在自然老化期間，由于溫度和相對濕度的持續作用，導致大豆蛋白質伸展、變性和聚集，降低了蛋白質量濃度，從而使蛋白質分子之間的碰撞機會即交聯機會減少，導致網絡結構不夠緊密，影響其穩定性[23]。同時，豆漿中蛋白質膠粒的帶電性也是影響豆漿穩定性的因素之一，大豆貯藏期間蛋白質變性，疏水基團暴露造成了蛋白質膠粒帶電性的改變，這在一定程度上也導致了豆漿穩定性的下降[20]。

由圖3B可知，隨著大豆自然老化時間的延長，豆漿的沉淀率呈現逐漸上升的趨勢。當自然老化超過8 個月后，豆漿的沉淀率曲線逐漸趨于平穩，無明顯上升，說明豆漿的沉淀性漸漸趨于穩定。對照組的沉淀率最低，為1.23%，自然老化4、6、8、10 個月后，豆漿的沉淀率分別為1.35%、1.47%、1.77%、1.78%，沉淀率分別上升了9.76%、19.51%、43.90%、44.71%。沉淀率的上升是由于大豆自然老化過程中，部分蛋白質在溫度和濕度的持續作用下變性聚集，形成大分子的聚集體[24]，而根據Stocks定律，溶液中顆粒的沉降速度與粒徑的平方成正比，即粒徑越大，沉降速率越快，因此造成豆漿的沉淀率升高[25]。

2.4 大豆自然老化時間對豆漿粒徑分布的影響

圖4 大豆自然老化時間對豆漿粒徑分布的影響Fig. 4 Effect of soybean natural aging time on particle size distribution of soybean milk

豆漿的粒徑與其穩定性有關，粒徑的減小有助于增加穩定性，并且賦予豆漿更加平滑的口感[26-27]。由圖4可知，對照組的大豆所制的豆漿在50.7 nm處出現1個峰，自然老化2、4 個月的大豆所制的豆漿分別在50.9 nm和342.1 nm處出現兩個峰；自然老化6 個月的大豆所制的豆漿分別在57.7 nm和342.1 nm處出現兩個峰；自然老化8 個月的大豆所制的豆漿分別在60.4 nm和342.1 nm處出現兩個峰；自然老化10 個月的大豆所制的豆漿分別在68.1 nm和396.0 nm處出現兩個峰；自然老化12 個月的大豆所制的豆漿分別在70.2 nm和396.0 nm處出現兩個峰。隨著自然老化時間從2 個月延長至12 個月，豆漿粒徑分布曲線呈整體右移的趨勢，平均粒徑也從229.6 nm增至312.9 nm。其原因是大豆在貯藏期間大豆蛋白變性，疏水基團向外伸展，蛋白質分子鏈展開，乳化脂肪球顆粒水溶性降低，此過程中蛋白質的聚合為主要趨勢，同時大豆纖維顆粒的聚集也導致豆漿的粒徑增大[10,26]。豆漿的粒徑與穩定性密切相關，隨著自然老化時間的延長，其粒徑增大，導致穩定性降低，與穩定性實驗結果一致。

2.5 大豆自然老化時間對豆漿主要風味物質的影響

圖5 不同自然老化時間的大豆所制得豆漿的揮發性風味物質總離子流圖Fig. 5 Effect of soybean natural aging time on total ion GC-MS profile of soybean milk flavor compounds

表1 大豆自然老化時間對豆漿的揮發性成分及其質量濃度的影響Table1 Effect of soybean natural aging time on the type and amount of volatile components in soybean milk mg/L

采用HS-SPME-GC-MS法提取豆漿中的風味物質的總離子流圖如圖5所示，其風味化合物的分析結果如表1所示。共檢出22 種化合物，其中醛類10 種，醇類5 種，酮類2 種，呋喃類2 種，酯類1 種，其他化合物2 種。自然老化2、4、6、8、10、12 個月的豆漿所檢出的共同風味物質12 種，占總風味物質的54.54%。己醛是豆漿豆腥味的主要組成成分[28]，具有非常濃郁的青草氣味。由表1可知，隨著老化時間的延長，己醛質量濃度整體呈現上升趨勢。自然老化12 個月所制豆漿的己醛質量濃度最高，為4.17 mg/L，與對照組相比其質量濃度上升了2.20%，其次是自然老化8 個月和10 個月，均為4.12 mg/L，其余由高到低分別為自然老化6、4、2 個月，己醛質量濃度分別為4.11、4.09、4.03 mg/L。正己醇質量濃度僅次于己醛，這與Xia Yixun等[29]的研究結果一致，而與李景妍[30]、楊蕊蓮[31]等的研究結果不一致，這可能是風味物質的萃取方式不同所造成。正己醇具有水果香味[32]，屬于非豆腥味物質。隨著自然老化時間的延長，正己醇質量濃度整體呈現下降趨勢。對照組的正己醇質量濃度最高，為3.57 mg/L，自然老化6、8、10、12 個月后其質量濃度分別為3.49、3.43、3.37、3.34 mg/L，下降幅度分別為2.24%、3.92%、5.60%、6.44%。1-辛烯-3-醇的質量濃度次于己醛和正己醇，其具有蘑菇香味，屬于非豆腥味物質[32]。隨著老化時間的延長，1-辛烯-3-醇的質量濃度整體呈現下降趨勢，與正己醇質量濃度的變化情況相仿。2-戊基呋喃具有青草氣味，隨著老化時間的延長，其質量濃度呈現下降的趨勢，對照組和自然老化2 個月時質量濃度最高，為0.26 mg/L，自然老化12 個月后其質量濃度下降為0.21 mg/L，下降幅度為19.23%。在本實驗中未檢測出醚類、酸類及烴類物質，可能與HS-SPME萃取頭涂層材料有關。

在所檢出的22 種風味物質中，有12 種物質的貢獻較大，其中己醛、正戊醇、2-戊基呋喃、壬醛、2-己烯醛這5 種化合物具有不愉快氣味，對豆腥味貢獻較大，而正己醇、1-辛烯-3-醇、2,3-辛二酮、辛酮、反-2-壬醛、辛醛、反,反-2,4-癸二烯醛這7 種化合物屬于非豆腥味物質[29]，具有令人愉快的氣味。結合表1可以看出，對照組豆漿共檢出16 種化合物，其中己醛、正戊醇、2-戊基呋喃、壬醛、2-己烯醛等具有豆腥味物質的質量濃度總和為5.67 mg/L，而正己醇、1-辛烯-3-醇、2,3-辛二酮、辛酮、反-2-壬醛、辛醛、反,反-2,4-癸二烯醛這7 種非豆腥味物質質量濃度總和為5.39 mg/L。自然老化2、4、6、8、10、12 個月后，豆腥味物質總質量濃度排名為：自然老化2 個月（5.66 mg/L）＜4 個月（5.78 mg/L）＜6 個月（5.95 mg/L）＜10 個月（6.01 mg/L）＜8 個月（6.05 mg/L）＜12 個月（6.07 mg/L）；非豆腥味物質總質量濃度排名為：自然老化2 個月（5.39 mg/L）＞4 個月＝6 個月（5.38 mg/L）＞8 個月（5.36 mg/L）＞10 個月＝12 個月（5.34 mg/L）。結果表明，隨著自然老化時間的延長，豆漿的豆腥味物質質量濃度逐漸增加，而非豆腥味物質質量濃度逐漸下降。綜上所述，自然老化時間對豆漿的風味物質有一定的影響，即隨著老化時間的延長，豆漿的風味品質下降，這可能是由于大豆自然老化期間其籽粒內不飽和脂肪酸及蛋白質發生了一系列的變化，而目前自然老化時間對豆漿風味物質影響的研究尚鮮見報道，并且豆漿的風味體系十分復雜，其形成機理目前尚未完全清晰，自然老化造成其風味物質變化的原因有待進一步研究。

3 結 論

自然老化是進行大豆貯藏性和品質改良最直接的方式，最終的目的是為了改善豆制品的食用品質，因此，研究自然老化對豆漿的影響具有現實意義。大豆在自然老化期間發生了一系列物理化學變化，導致了所制豆漿的營養成分及風味品質均有一定程度的下降。大豆自然老化6～8 個月期間，豆漿的可溶性固形物、脂肪、蛋白質含量、蛋白質提取率及穩定系數下降幅度最大，分別為1.53%、6.92%、1.70%、0.77%、5.41%，沉淀率上升幅度最大，為20.41%。綜合考慮大豆自然老化的質量損失和豆漿的品質指標，建議大豆的貯藏時間應盡可能控制在6 個月內。

本實驗只針對自然老化時間對豆漿品質的影響進行了研究，并未對老化的方式、溫度、濕度等因素進行研究，為了進一步提高豆漿品質，后續可以繼續研究老化的溫度和濕度對豆漿的品質影響。