迷迭香提取物在體外和薩拉米中的抗氧化活性

姜 蕾，康大成，張萬剛，周光宏

（南京農業大學 肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京 210095）

薩拉米是一種典型的西式發酵香腸，其以豬肉、牛肉為原料，利用微生物或組織內源酶發酵作用生產，經發酵干燥而成。因其具有特殊的風味、色澤和質地而深受世界各地消費者的喜愛，然而在長期高溫高濕的加工條件下，薩拉米易發生過度氧化。在加工過程中，適度的脂肪氧化、蛋白質氧化、水解等反應可產生醛類、醇類等風味物質，有利于薩拉米的品質形成。此外，脂質氧化產生的一級產物還可與氨基酸、肽等發生美拉德反應，進一步形成大量的風味成分[1-2]。但過度氧化會對其風味、質地和色澤等品質產生不良影響。薩拉米的脂肪含量相對較高，脂肪過度氧化會產生哈喇味，從而嚴重影響產品的感官品質和食用品質[3]。同時，現代醫學研究表明，脂肪氧化產物可誘發多種慢性疾病，是人體衰老和心血管疾病的主要誘因[4]。因此，在生產過程中控制好脂肪和蛋白質的氧化程度對薩拉米風味的形成和品質控制至關重要[5]，有助于提高產品的品質和安全性，延長產品的貨架期。

控制發酵香腸氧化酸敗的常用方法是添加抗氧化劑。目前工業上使用的大多數是合成抗氧化劑，雖然抗氧化效果好，但其安全性一直備受質疑，因此在很多國家，化學合成的抗氧化劑已經被禁止使用在肉制品中。現在人們逐漸將目光轉向天然抗氧化劑。研究證明，許多藥草以及植物香辛料提取物都具有很好的抗氧化和抑菌作用[6]，迷迭香便是其中比較常見的一種。Jongberg等[7]發現迷迭香提取物可以有效抑制脂肪氧化導致的硫代巴比妥酸反應產物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）和蛋白質氧化形成的羰基含量上升。孫衛青[8]研究發現迷迭香提取物可以有效抑制豬肉和牛肉切片火腿的脂肪氧化，還能減緩色素亞硝酰血色原的降解，提高切片火腿的紅度。殷燕等[9]研究發現迷迭香提取物能顯著抑制熟豬肉餅貯藏過程中的脂肪氧化和微生物生長，并能在一定程度上改善熟豬肉餅的顏色和質構。Doolaege等[10]發現迷迭香提取物抑制豬肝肉醬的脂質氧化效果顯著。劉騫等[11]研究發現，在冷藏牛肉丸中迷迭香提取物的抗氧化性能優于丁香和肉桂提取物，略差于丁基羥基茴香醚。Nissen等[12]的實驗也表明熟肉餅中添加迷迭香提取物的抗氧化效果顯著優于添加茶、葡萄皮和咖啡提取物。以上研究表明迷迭香提取物在肉制品中的抗氧化效果較為顯著，并且有利于維持肉制品色澤的穩定、抑制微生物的生長，還能賦予肉制品一定的風味。色澤和風味對于薩拉米的品質來說尤為重要，因此本實驗將迷迭香提取物添加到薩拉米中，研究其對薩拉米抗氧化和食用品質的影響，并與人工合成的抗氧化劑進行對比，探討迷迭香提取物在薩拉米中的商業化應用，及其替代合成抗氧化劑的可能性，提高肉制品的品質穩定性及安全性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

迷迭香粉 河南森源本草天然產物股份有限公司；原料肉（豬瘦肉、豬背膘、牛肉） 江蘇食品集團；發酵劑F1 科漢森食品添加劑有限公司；膠原蛋白腸衣（Ф＝23 mm） 廣西神冠蛋白腸衣有限責任公司；1,1-二苯基-2三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）試劑盒美國Cell Biolabs公司；L-半胱氨酸 梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；鹽酸胍、Tris-Base 合肥新恩源生物技術有限公司；牛血清白蛋白 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

ZKSY-600恒溫水浴鍋 南京科爾儀器設備有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；冷凍干燥機 德國Christ公司；AvantiJ-E離心機 美國Beckman Coulter公司；Spectral Max?M2e多功能酶標儀美國MD公司；8010ES高速勻漿機 美國Warring公司；TC 12E絞肉機 意大利Sirman公司；BZBI-15斬拌機嘉興艾博不銹鋼機械工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 迷迭香提取物的制備

參考謝冬惠[13]的方法并稍作改動。稱取迷迭香粉末100 g，加入500 mL體積分數70%乙醇溶液，70 ℃水浴加熱回流提取2 次，每次2 h，過濾后獲得迷迭香樣品液，將樣品液旋轉蒸發回收溶劑得到濃縮液，將濃縮液真空冷凍干燥48 h得到迷迭香乙醇提取物。將提取物包裝后于4 ℃冷庫保存待用。

1.3.2 薩拉米的制作

薩拉米配方：65%豬瘦肉（質量分數，下同）、30%豬背膘、5%牛肉。0.01%亞硝酸鈉、0.01%硝酸鉀、3.7%香辛料（食用鹽、葡萄糖、黑胡椒粉、小茴香粉、大蒜粉等）、0.025%發酵菌種F1。本實驗設定5 個實驗組：空白對照組（CK組，不添加抗氧化劑）、陽性對照組（SE組，添加0.02%異抗壞血酸鈉），分別添加0.01%、0.02%、0.03%迷迭香提取物的3 個處理組（R0.01組、R0.02組、R0.03組）。

工藝流程：原料肉預處理→絞碎→腌制（將迷迭香提取物粉末與其他香辛料一起混勻，直接加入絞碎的肉中）→接種→斬拌→灌裝→發酵→成熟→真空包裝→成品。

本實驗選取5 個取樣時間點：分別是第0天（所有成分混合均勻后和灌腸前）、第2天（發酵結束）、第7天（干燥過程）、第10天（干燥過程）、第14天（干燥結束后的成品）。對5 個實驗組分別取樣測試，每個實驗組3 個重復。

1.3.3 迷迭香提取物總酚含量的測定

參照Hinneburg等[14]的方法并適當修改。準確稱取0.2 g迷迭香提取物粉末，用體積分數70%乙醇溶液溶解后定容于100 mL容量瓶中，配制成2 mg/mL的母液。吸取0.1 mL母液于10 mL容量瓶中，依次加入1.0 mL福林-酚試劑和3.0 mL 100 g/L的Na2CO3溶液，蒸餾水定容、混勻。室溫下避光反應2 h，于765 nm波長處測吸光度。用沒食子酸作標準液繪制標準曲線，將吸光度代入回歸方程，計算多酚質量濃度/（μg/mL）。迷迭香提取物中的多酚含量以沒食子酸標準品計，結果以每克提取物中沒食子酸的質量表示。用提取溶劑作空白對照。

1.3.4 迷迭香提取物體外抗氧化活性的測定

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力的測定

參考Mielnik等[15]的方法并稍作改進。用體積分數70%乙醇溶液將迷迭香提取物粉末溶解并稀釋至不同質量濃度，取1 mL樣品溶液與1 mL DPPH自由基溶液（0.2 mmol/L，體積分數70%乙醇溶液溶解）混合，充分混勻后于室溫避光放置30 min。在517 nm波長處測定混合液的吸光度，記為A1，1 mL體積分數70%乙醇溶液與1 mL DPPH自由基溶液混合作為空白組，吸光度記為A0。用1 mL樣品溶液與1 mL體積分數70%乙醇溶液混合作為對照，吸光度記為A2。迷迭香提取物對DPPH自由基的清除率按下式計算。

同時，配制與上述樣品溶液相同質量濃度梯度的異抗壞血酸鈉作為對照，按照上述測定方法檢測其DPPH自由基清除率。

1.3.4.2 ORAC的測定

參考Huang Dejian等[16]的方法并作適當修改。迷迭香提取物和抗氧化標準物質水溶性VE（Trolox）用體積分數70%乙醇溶液溶解并稀釋至不同質量濃度。熒光物質、自由基產生劑2,2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH）均用磷酸鹽緩沖液（75 mmol/L、pH 7.2）溶解并稀釋至適當濃度，ORAC反應在磷酸鹽緩沖液體系中進行。吸取25 μL不同質量濃度的待測樣品溶液于96 孔的黑色熒光酶標板各微孔中，加入150 μL熒光物質溶液（8.61×10－5mmol/L），混勻，在37 ℃下孵育30 min，再加入25 μL AAPH溶液（153 mmol/L），混勻后立即在37 ℃條件下，以激發波長480 nm、發射波長520 nm連續測定熒光強度，每2 min測定一次熒光強度，直至熒光衰減呈基線后測定結束，共測定60 次。本實驗需要設定兩種對照，即沒有添加熒光物質的熒光自然衰減對照（記為－AAPH）和沒有樣品溶液存在時的自由基對照（記為＋AAPH）。

抗氧化劑的ORAC是通過抗氧化劑的保護面積與標準抗氧化物質的保護面積相比得出。待測樣品的ORAC以μmol Trolox/g表示。

同時，配制與上述樣品溶液相同質量濃度梯度的異抗壞血酸鈉作為對照，按照上述方法測定其ORAC。

1.3.4.3 還原力測定

參考鄭錦曉等[17]的方法并稍作改進。配制不同質量濃度的樣品溶液，取2 mL樣品溶液與2 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L、pH 6.6）和2 mL鐵氰化鉀溶液（10 mg/mL）混勻，50 ℃水浴20 min。再加入2 mL三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）（100 mg/mL）溶液，將混合液在3 000 r/min離心10 min。吸取2 mL上清液，加入2 mL蒸餾水和0.4 mL三氯化鐵（質量分數0.1%），充分混勻，室溫避光放置10 min后于700 nm波長處測其OD值。反應體系的OD值越高表明還原力越強。

同時，配制與上述樣品溶液相同質量濃度梯度的異抗壞血酸鈉作為對照，按照上述測定方法檢測其還原力。

1.3.5 薩拉米氧化指標的測定

1.3.5.1 TBARS含量的測定

參考Raharjo[18]和Wang[19]等的方法并稍作改進，取5 g肉樣，加入20 mL蒸餾水和25 mL質量分數20% TCA溶液，在冰水浴中10 000 r/min勻漿兩次，每次30 s。然后以4 ℃、4 000 r/min離心10 min，過濾，濾液用蒸餾水定容至50 mL，取2 mL濾液加入2 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸，在95 ℃水浴80 min，取出用流水冷卻10 min，再以4 000 r/min離心，取上清液在523 nm波長處測吸光度。空白樣為25 mL 20%質量分數TCA溶液加蒸餾水定容至50 mL，其他步驟如上所述。用四乙氧基丙烷作標準曲線，TBARS含量通過標準曲線計算，結果以每千克樣品中丙二醛（malondialdehyde，MDA）的質量表示。

1.3.5.2 總巰基含量的測定

參考Fu Qingquan等[20]的方法，取1 g肉樣，加入5 mL的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）混勻，在8 000 r/min條件下勻漿30 s。取0.1 mL勻漿液于離心管中，加入0.9 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0，其中包含8 mol/L的尿素、10 mmol/L的乙二胺四乙酸和0.6 mol/L的氯化鉀），再加入0.04 mL 10 mmol/L 5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）。混合液在40 ℃條件下反應25 min。在10 000×g條件下離心5 min，取上清液在412 nm波長處測其吸光度。用二辛可酸法測蛋白質量濃度后，以半胱氨酸作標準曲線計算總巰基含量。

1.4 數據統計分析

實驗重復3 次，所有數據采用SAS 8.0軟件進行統計分析，差異顯著性分析采用Duncan’s Multiple Range Test模式，用Graphpad Prism軟件作圖，數據表示為，以P＜0.05表示差異顯著，以P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 總酚含量的測定結果

本研究測定的回歸方程為：y＝0.048 3x＋0.002 6，相關系數為0.995 3。將吸光度代入回歸方程，計算得出迷迭香70%乙醇提取物中總酚含量為197.6 mg/g（19.8%），稍高于Calabrese等[21]測得的迷迭香總酚含量（18.5%）。有研究表明，迷迭香提取物中起抗氧化作用的主要成分為酚類物質[22]。迷迭香的生長環境和加工貯藏方式等可能會影響迷迭香提取物中總酚含量，提取溶劑和檢測方法的不同也會造成總酚含量的差異。

2.2 迷迭香提取物體外抗氧化活性評價結果

2.2.1 DPPH自由基清除能力

圖1 迷迭香提取物和異抗壞血酸鈉對DPPH自由基的清除效果Fig. 1 Scavenging effect of rosemary extract and sodium erythorbate on DPPH free radicals

如圖1所示，質量濃度在5～500 μg/mL之間時，迷迭香提取物DPPH自由基清除率為24.63%～100.00%，異抗壞血酸鈉DPPH自由基清除率在29.85%～78.44%之間。當質量濃度小于80 μg/mL時，迷迭香提取物的DPPH自由基清除能力顯著低于異抗壞血酸鈉（P＜0.05）；當質量濃度大于80 μg/mL時，迷迭香提取物的DPPH自由基清除能力顯著高于異抗壞血酸鈉（P＜0.05）。這可能是由于DPPH自由基為脂溶性，本實驗所提取的迷迭香提取物也為脂溶性，在質量濃度較高時二者的親和作用更顯著[23-24]。而且異抗壞血酸鈉在較高質量濃度下可能存在自氧化現象，這會導致其清除率有所下降。張瑩[25]的研究表明，迷迭香的DPPH自由基清除能力與其酚類物質含量呈正相關。

2.2.2 迷迭香提取物的ORAC

圖2 Trolox系列濃度標準溶液的熒光強度隨時間衰減曲線Fig. 2 Attenuation curve of fluorescence intensity of Trolox standard solutions

如圖2所示，Trolox系列濃度標準溶液的標準曲線回歸方程為y＝0.413 6x＋3.954 7，相關系數為0.995 7。迷迭香提取物的ORAC為2 920.3 μmol Trolox/g，顯著高于異抗壞血酸鈉的ORAC（1 746.9 μmol Trolox/g）（P＜0.01）。徐維盛等[26]對山楂的ORAC與其不同抗氧化活性成分含量進行了相關性分析，結果表明山楂鮮果ORAC與其多酚含量存在正相關關系。迷迭香提取物具有較高的ORAC，可能也與其較高的總酚含量有關。

2.2.3 還原力的測定結果

圖3 迷迭香提取物和異抗壞血酸鈉的還原能力Fig. 3 Reducing power of rosemary extract and sodium erythorbate

從圖3可看出，在5～300 μg/mL質量濃度范圍內，迷迭香提取物的還原力隨著質量濃度的升高而顯著增強（P＜0.05），但各個質量濃度下的清除率均顯著低于異抗壞血酸鈉（P＜0.05）。在質量濃度為400 μg/mL和500 μg/mL時，迷迭香提取物的還原力與異抗壞血酸鈉無顯著差異。說明在達到一定的質量濃度時，迷迭香提取物表現出了較好的還原能力，且還原效果與異抗壞血酸鈉相當。

上述3 種體外抗氧化評價體系的結果表明，總酚含量為197.6 mg/g的迷迭香提取物具有良好的清除DPPH自由基和活性氧自由基的能力以及還原力。因此，可對迷迭香提取物作為天然抗氧化劑應用在發酵香腸薩拉米中的抗氧化效果進行進一步的研究。實驗參考上述體外抗氧化活性結果中質量濃度范圍，分別將質量分數為0.01%、0.02%和0.03%的迷迭香提取物應用到薩拉米的制作中，測定其對薩拉米加工過程中脂肪和蛋白質氧化的影響。

2.3 迷迭香對薩拉米加工過程中脂肪和蛋白質氧化的影響

2.3.1 迷迭香對薩拉米TBARS含量的影響

圖4 不同質量分數迷迭香提取物對薩拉米加工過程中TBARS含量的影響Fig. 4 Effects of different amounts of rosemary extract added on TBARS contents of salami during processing

脂肪氧化程度是決定食品質量的重要因素，它能導致食品變色及產生不良氣味，影響食品的食用安全[27]。TBARS含量是評價脂肪過氧化程度的重要指標，主要反映了脂肪次級氧化產物MDA的含量[28]。隨著脂肪氧化程度的加深，次級產物不斷增多，TBARS含量也不斷增大。由圖4可知，薩拉米在整個加工過程中TBARS含量總體呈上升趨勢，在發酵期間上升緩慢，可能是由于發酵產物的大量生成，而發酵產物本身就具備一定的抗氧化能力[29]，干燥后期TBARS含量上升迅速。在第0、2、7天，5 個實驗組之間的TBARS含量沒有顯著差異。在第10天，R0.03組的TBARS含量顯著低于CK組，其他4 個實驗組之間的TBARS含量無顯著差異。第14天，SE組和R0.03組的TBARS含量顯著低于CK組（P＜0.05），R0.02組和R0.01組的TBARS含量與CK組無顯著差異。說明在加工過程中，R0.03組可以顯著抑制薩拉米TBARS含量的升高，SE組次之；R0.02組與R0.01組不能顯著抑制薩拉米在加工過程中TBARS含量的升高。在加工結束時，R0.03組的TBARS含量顯著低于SE組，說明質量分數0.03%的迷迭香提取物可以有效地減輕薩拉米脂肪過氧化情況。有報道認為，迷迭香中的迷迭香酚、鼠尾草酸等酚類物質可以替代自由基與不飽和脂肪酸結合，從而抑制脂肪氧化[30]。Lara[31]和殷燕[32]等的研究表明，添加了迷迭香提取物的豬肉餅在0～3 d的冷藏期間自由基團的含量顯著高于對照組，說明迷迭香發揮了替代自由基與不飽和脂肪酸結合的作用。

2.3.2 迷迭香對薩拉米總巰基含量的影響

圖5 不同質量分數迷迭香提取物對薩拉米加工過程中總巰基含量的影響Fig. 5 Effects of different amounts of rosemary extract added on total thiol content of salami during processing

所有蛋白質的氨基酸側鏈均可被自由基攻擊，但不同氨基酸對自由基的敏感程度不同。半胱氨酸具有高度敏感的含硫元素活性中心，因此在所有氨基酸殘基中，半胱氨酸最容易被氧化形成二硫鍵導致巰基消失[33]。總巰基含量可以用來反映蛋白質氧化的程度[34]，總巰基含量越低表示蛋白質氧化程度越嚴重[35]。從圖5可看出，在加工過程中，薩拉米的總巰基含量在0～2 d顯著下降（P＜0.05）。在第0天時，5 個實驗組的總巰基含量無顯著差異。在第2天時，SE組的總巰基含量顯著高于其他4 個處理組。在第7天時，R0.03組的總巰基含量顯著高于SE組，在第10、14天時R0.03組的總巰基含量與SE組無顯著差異（P＜0.05）。在第14天時，添加迷迭香的3 個處理組的總巰基含量均與SE組無顯著差異，除R0.01組外，SE組和其余兩個迷迭香處理組的總巰基含量均顯著高于CK組（P＜0.05）。本實驗中，在發酵期間的第0、2天，所有樣品的總巰基含量均呈現出快速大幅下降的趨勢，這主要是由于發酵期間蛋白質量濃度迅速提高了3～5 倍，蛋白質量濃度的迅速升高可能是由于發酵初期乳酸菌等發酵菌種大量繁殖，菌體蛋白也會被二辛可酸法檢測出，并與肌肉中的蛋白質一起被計入結果，因此導致蛋白質量濃度的升高。添加的發酵菌種在發酵過程中產生大量乳酸等有機酸，對肌肉中的結締組織有弱化作用，從而使肌肉中的不可溶性膠原蛋白轉化為可溶性膠原蛋白，也可能導致蛋白質量濃度有所上升[36]。另外，pH值下降可能會造成肌原纖維蛋白的解綁以及吸附能力下降，使肌原纖維的結構遭到破壞，提高肌球蛋白和肌動蛋白的溶出能力[37]，同時pH值下降也會造成蛋白質水解酶活性下降。研究表明胰蛋白酶的含量下降會導致總巰基含量的下降[38]。第7、10、14天的蛋白質量濃度相對較穩定，因此這3 個時間點的總巰基含量變化更具有參考意義。通過第7、10、14天3 個時間點的總巰基含量可以看出，添加質量分數為0.02%和0.03%的迷迭香提取物可以顯著抑制薩拉米的蛋白質氧化，并且呈現出一定的量效關系，0.03%的迷迭香提取物抑制蛋白質氧化效果與異抗壞血酸鈉相當。

3 結 論

本研究對迷迭香提取物在體外和薩拉米中抗氧化活性的各項指標進行測定，結果表明：迷迭香提取物在體外具有良好的清除DPPH自由基和活性氧自由基的能力以及還原力；適宜質量分數的迷迭香提取物可以有效抑制薩拉米加工過程中的脂肪氧化，并且效果優于合成抗氧化劑異抗壞血酸鈉，其在抑制蛋白質氧化方面也與異抗壞血酸鈉效果相當。因此可以考慮在薩拉米等發酵肉制品中將其用于替代合成抗氧化劑，以保證發酵肉制品的安全性。