不同熱加工方式對核桃蛋白致敏性的影響

姜松松，趙 博，韓詩雯，車會蓮

（北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

食物過敏已經成為一個世界范圍內嚴重的公共衛生問題，嚴重影響人們的生活質量。有研究指出，超過90%的食物過敏都是由小麥、花生、大豆、堅果類、牛奶、雞蛋、魚和甲殼類這8 類食物引起的[1]，其中核桃引起的過敏是一種嚴重的堅果過敏，常常伴隨著嚴重的臨床癥狀，甚至導致休克和死亡[2-3]。目前，不少研究證實，核桃過敏主要是免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）E介導的速發型過敏反應[4-6]，而利用核桃過敏患者血清發現的核桃過敏原包括Jug r 1、Jug r 2、Jug r 3、Jug r 4[7-9]，其中Jug r 1可以被80%以上的核桃過敏患者血清所識別，被認為是核桃中的主要過敏原蛋白[10]。

通過不同的加工方式能夠改善食物的功能、營養、感官等性質，在加工過程中，食物蛋白的物理特性和化學結構常常會發生變化。此前有研究發現，將魚煮熟后食用能夠引發過敏反應，而生魚不能[11]，這引起了人們對加工能否影響食物蛋白致敏性的關注。有研究發現，對牛奶中β-乳球蛋白進行加熱處理可顯著降低其致敏性[12]；Alvarez-Alvarez等[13]發現，高壓處理羽扇豆能夠通過降低其IgE結合能力來降低其致敏性；而Maleki等[14]發現，烤花生可以增強其IgE結合能力，從而增強其致敏性。這些研究結果提示不同的加工方式對不同蛋白的致敏性影響不同，這主要是因為不同的加工方式對食物蛋白結構等性質的影響不同。大多數的物理過程（加熱、加壓、輻射和超聲）主要通過改變食物蛋白的二級和三級結構來影響構象表位（破壞、掩蓋、暴露），而生物化學加工方式一般通過酸水解、酶水解或者劇烈的美拉德反應來改變食物蛋白的線性表位從而影響食物蛋白致敏性。Cabanillas等[15]發現核桃蛋白經高壓處理后Jug r 4的IgE結合能力顯著降低，提示高壓處理能夠有效降低核桃蛋白抗原性。但其他一些常用的加工方式對核桃蛋白致敏性的影響仍缺少相關研究。

熱處理是食品中應用最普遍的加工技術，能夠通過改變分子內、分子間的共價鍵或非共價鍵的相互作用，破壞二級結構和三級結構，影響構象表位，改變食物蛋白致敏性。本研究首先對核桃蛋白進行粗提取，然后分別對其進行煮沸、烘烤、高溫高壓以及微波等不同的熱處理，通過對核桃蛋白可提取質量濃度、核桃過敏患者血清IgE結合能力及兔多克隆抗體IgG結合能力的變化，分析不同熱處理方式對核桃蛋白抗原性、致敏性的影響，旨在探索能夠有效降低核桃蛋白致敏性的熱處理方法，從而為研發低致敏性或無致敏性核桃制品提供科學依據，保障核桃過敏患者的安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用血清來自于6 個對核桃過敏的患者，篩選條件為：具有攝食核桃之后發生系統過敏反應的病史，或者在醫院進行皮膚點刺實驗對核桃產生陽性反應。過敏原特異性IgE抗體篩查定量檢測顯示其血清中核桃特異性IgE水平在0.6～2.7 kU/L之間。采用兩個對雞蛋過敏而非核桃過敏的受試者血清樣本作為對照組，本研究獲得中國農業大學人體研究倫理委員會批準（批準號：0312150129），均取得血清提供者的知情同意。

核桃（Juglans regia）產自中國天津薊縣。二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒美國Novagen公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記羊抗兔IgG抗體 美國Cell Signaling Technology公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 美國Sigma公司；四甲基聯苯胺顯色液美國Promega公司；乙二胺四乙酸 北京藍弋公司。

1.2 儀器與設備

5804 R型低溫高速離心機 德國Eppendoff公司；多功能旋轉搖床 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DYY-6C-電泳儀 北京六一儀器廠；電轉儀 美國Bio-Rad公司；GelDoc-ItTM影像系統 美國UVP公司；Varloskan Flash多功能酶標儀 美國Thermo Scientific公司；MSL-3750高壓滅菌鍋 日本Sanyo公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃蛋白粗提取及熱處理

去除核桃外硬殼并去皮，液氮研磨成細粉末。稱取l0 g所得核桃粉，加入100 mL正己烷溶液，于4 ℃磁力攪拌脫脂2 h，然后于4 ℃ 8 000×g離心30 min，棄上清液，將所得沉淀再重復脫脂1 次，置于通風櫥內晾干備用。

對上述獲得的核桃蛋白粗提取物進行不同方式的熱處理，包括濕熱、干熱、高溫高壓、微波加熱[16]，詳見表1。處理后樣品分別使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）溶解（1∶20，m/V），4 ℃攪拌過夜，將溶液10 000×g離心20 min，取上清液使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白質量濃度測定。

表1 不同熱處理方式Table1 Description of treatments applied to walnut powders

1.3.2 Jug r 1多克隆抗體制備

使用凝膠過濾層析以及陰離子交換層析的方法[17]純化出核桃致敏蛋白Jug r 1。以此作為抗原，制備多克隆抗體[18]：基礎免疫以500 μg Jug r 1抗原溶于2 mL弗氏完全佐劑中，使之充分乳化，皮下多點注射新西蘭家兔。加強免疫時用弗氏不完全佐劑，抗原劑量為首次的1/2。每2～3 周加強免疫1 次。在每次加強免疫之后1 周，從耳緣靜脈取血2～3 mL，分離血清，用酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法檢測抗體效價，直至抗體效價在1∶10 000以上。大量采血，室溫凝固后4 ℃冷藏4 h，離心分離血清，使用正辛酸-硫酸銨兩步沉淀法純化多克隆抗體，－20 ℃冷凍保存。

1.3.3 SDS-PAGE分析

采用電泳儀進行不連續雙垂直板十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析熱處理對不同核桃蛋白質量濃度的影響。將核桃蛋白粗提取物與樣品緩沖液（pH 6.8、0.5 mol/L Tris-HCl緩沖液2.0 mL、無水丙三醇2.0 mL、20%十二烷基硫酸鈉2.0 mL、質量分數0.1%溴酚藍0.5 mL、β-巰基乙醇1.0 mL、去離子水2.5 mL）按1∶1的體積比混合，100 ℃煮沸5 min，離心，上樣20 μL，分離膠質量濃度12 mg/100 mL，濃縮膠質量濃度3.9 mg/100 mL。開始電流10 mA，進入分離膠后電流為20 mA，電泳時間2.5～3.5 h?？捡R斯亮藍R-250染色過夜，放入脫色液中脫色，直至膠片背景藍色變為完全透明狀，電泳自動成像儀拍照，使用Image J軟件進行半定量分析。

1.3.4 血清學分析

1.3.4.1 Dot blot實驗

采用斑點印跡（Dot blot）實驗分析不同熱處理方式對核桃蛋白IgE結合能力的影響。使用0.01 mol/L PBS（pH 7.4）稀釋上述各處理組的3 mg/mL蛋白溶液，取2 μL點于硝酸纖維素膜上，置于37 ℃恒溫箱中干燥20～30 min，使蛋白吸附至膜上；使用TBST/5% BSA封閉1 h，使用6 個對核桃過敏患者血清（每兩個分為一組，混合成3 個血清池）以體積比1∶10稀釋進行孵育，4 ℃過夜；一抗孵育后，用TBST洗滌6 次，加入質量比1∶8 000生物素標記的羊抗人IgE抗體，37 ℃孵育1 h，用TBST洗滌6 次；再加入質量比1∶500 HRP標記的鏈霉親和素37 ℃孵育1 h，TBST洗滌6 次后使用二氨基聯苯胺（diaminobezidin，DAB）染液避光孵育顯色，去離子水沖洗終止反應。分析核桃蛋白粗提取物與過敏患者血清IgE的結合能力。

1.3.4.2 Western blot實驗

采用免疫印跡（Western blot）實驗進一步分析核桃中主要過敏原Jug r 1的IgE、IgG結合能力的變化。對各處理組的核桃粗提取物進行SDS-PAGE分析后，在80 V下恒壓電轉2 h，將蛋白條帶印跡到硝酸纖維素膜上。采用TBST（5% BSA）封閉1 h，加入制備的抗Jug r 1蛋白的兔多抗血清或過敏病人血清孵育過夜。一抗孵育完后，用TBST洗滌6 次，用HRP標記羊抗兔IgG抗體或羊抗人IgE抗體孵育1 h，用TBST洗滌8 次。加DAB顯色液孵育5 min，顯色后去離子水沖洗，照相。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 熱處理方式對核桃蛋白質量濃度的影響

使用BCA試劑盒對不同熱處理后核桃蛋白的可提取質量濃度進行分析，如圖1A所示，與對照組相比，干熱、濕熱及高溫高壓處理后，可提取核桃總蛋白的質量濃度顯著降低（P＜0.05），其中高溫高壓處理的效果最為顯著，可提取總蛋白質量濃度降為（6.84±0.10）mg/mL，降低了32.3%，這可能是由于高溫高壓引起部分蛋白質變性凝固，從而降低了其可提取蛋白質量濃度。與對照組相比，微波處理組反而在一定程度上增加了核桃蛋白的可提取質量濃度，這可能與微波加熱的作用方式有關。

核桃主要過敏原為Jug r 1，其分子質量約為16 kDa[10]。采用SDS-PAGE進一步分析不同熱處理方式對Jug r 1質量濃度的影響。如圖1B所示，在16 kDa處，與對照組相比，干熱處理的電泳條帶灰度未發生顯著變化；濕熱、高溫高壓處理組的電泳條帶灰度顯著降低；微波處理組的蛋白條帶灰度略有加深。這提示干熱處理對核桃中Jug r 1的質量濃度沒有顯著影響，濕熱和高溫高壓處理顯著降低了Jug r 1的可提取質量濃度，而微波處理增加了核桃中Jug r 1的可提取質量濃度，這與上述BCA法測定蛋白質量濃度結果基本一致。

圖1 不同熱處理提取核桃蛋白質量濃度（A）和SDS-PAGE分析（B）Fig. 1 Walnut protein concentration (A) and SDS-PAGE (B) of protein extracts walnuts from subjected to different thermal treatments

2.2 熱處理方式對核桃蛋白IgE結合能力的影響

絕大多數的核桃過敏反應由IgE介導，IgE與肥大細胞等效應細胞表面的Fc受體結合，過敏原再次進入機體后，與肥大細胞表面的IgE抗體結合，形成橋聯，引起脫顆粒反應，釋放出炎性介質，從而引起臨床癥狀[19]。為探究不同熱處理方式對核桃蛋白IgE結合能力的影響，對收集的6 個核桃過敏患者的血清進行Dot blot實驗。結果如圖2A所示，干熱處理對核桃蛋白與IgE結合程度沒有明顯影響，濕熱和高溫高壓處理顯著降低了核桃蛋白與病人血清池中IgE的結合程度，尤其經高溫高壓處理后，核桃蛋白幾乎已不能與患者血清池中IgE結合，而微波處理在一定程度上增強了核桃蛋白與患者血清池中IgE的結合程度。

為了對其結合程度進行精確量化，使用Image J軟件對Dot blot實驗的結果進行半定量分析，結果如圖2B所示。以患者血清池與對照組蛋白結合的灰度作為基準，與對照組相比：干熱處理對核桃蛋白與IgE的結合能力沒有顯著影響（P＞0.05）；濕熱和高溫高壓處理顯著降低了核桃蛋白與核桃過敏患者血清中IgE的結合能力（P＜0.05），分別降低了約50%、90%；而微波處理使核桃蛋白的IgE結合能力顯著增強了約30%（P＜0.05），這提示高溫高壓能夠顯著降低核桃蛋白的抗原性，而微波處理能夠顯著增強其抗原性。

由于Dot blot實驗使用的是核桃粗蛋白，因此，采用Western blot實驗進一步探究核桃蛋白中主要發揮致敏性作用的蛋白。結果如圖2C所示，所選取的兩名核桃過敏患者的血清都在10～17 kDa以及20～30 kDa處有結合條帶，根據分子質量推測前者為核桃中主要過敏原Jug r 1，而后者的電泳遷移規律與過敏原數據庫中已知的4 種核桃致敏原蛋白并不相符，因此推測這可能是一種并未被鑒定與表征的核桃過敏原蛋白。結果顯示，濕熱和高溫高壓處理顯著降低了核桃主要過敏原Jug r 1與核桃過敏患者血清IgE的結合能力（P＜0.05），其中高溫高壓處理效果最顯著，而干熱處理對Jug r 1的IgE結合能力沒有顯著影響，微波處理一定程度上增強了Jug r 1的IgE結合能力，這和Dot blot實驗的結果基本一致。

圖2 Dot blot實驗（A）、相對灰度分析（B）以及IgE免疫印跡實驗（C）Fig. 2 Results of dot blot tests (A), relative gray value analysis (B) and IgE immunoblotting tests (C)

2.3 熱處理方式對核桃蛋白IgG結合能力的影響

圖3 IgG免疫印跡結果（A）和相對灰度分析（B）Fig. 3 Results of IgG immunoblotting tests (A) and relative gray value analysis (B)

本研究中收集了6 名核桃過敏患者的血清以分析不同熱處理方式對核桃蛋白抗原性的影響，但其血清中IgE濃度相對較低，為進一步確定不同熱處理方式對核桃蛋白抗原性的影響，使用核桃主要過敏原Jug r 1制備的特異性多克隆抗體進行Western blot實驗。如圖3所示，在分子質量約為15 kDa處有明顯的結合條帶（箭頭指示），與Jug r 1約16 kDa的表觀分子質量相吻合，除了80 kDa左右存在少量非特異性條帶外，蛋白與多克隆抗體的特異性結合能力很強。結果顯示：干熱處理對核桃蛋白的IgG結合能力沒有顯著影響（P＞0.05）；濕熱和高溫高壓處理顯著降低了核桃蛋白IgG的結合能力（P＜0.05），分別降低了40%、80%；而微波處理一定程度上提高了核桃蛋白的IgG結合能力。這說明濕熱和高溫高壓處理顯著降低了核桃蛋白的IgG結合能力，提示這兩種處理方式能夠有效降低核桃蛋白抗原性，這與利用核桃過敏患者血清研究的結果一致。

3 討 論

核桃是蛋糕和餅干等烘焙產品重要的添加原料，同時也是一類主要的堅果過敏源[20]，無意添加或者加工過程中的交叉污染可能會危及核桃過敏者的健康甚至生命[21]。熱處理是一種常用的蛋白改性手段，也是食品加工過程中常規的工藝流程，能夠影響食物蛋白的溶解度和結構等理化性質，既而可能影響其致敏性。

本研究選取常用的幾種熱處理方式，探究了不同方式對核桃蛋白致敏性的影響。首先檢測了不同熱處理后核桃蛋白可提取質量濃度的變化，隨后使用核桃過敏患者血清檢測不同方式對核桃IgE結合能力的變化，分析其對核桃蛋白抗原性的影響。但是，由于核桃過敏患者血清不易收集，本研究中只收集到了6 名核桃患者的血清，且其血清中IgE水平較低，樣本的數量及IgE水平可能會限制核桃蛋白抗原性變化檢測的準確性；因此，本研究制備了Jug r 1多克隆抗體以研究其IgG結合能力，進一步分析不同熱處理方式對核桃蛋白抗原性的影響。

干熱和濕熱是熱處理中常用的兩種方式。有研究顯示，花生中的過敏原Ara h1和Ara h2的致敏性在經過烘烤后會增加，但是經過水煮后顯著降低[14,22]。本研究發現，干熱處理對核桃蛋白的IgE結合能力、IgG結合能力都沒有顯著影響，而濕熱處理顯著降低了核桃蛋白的IgE和IgG結合能力，提示相比于干熱處理，濕熱處理能更顯著地降低核桃蛋白抗原性。這可能是由于兩種加熱方法的升溫和熱處理模式不同，水分含量也不一樣，導致蛋白質分子發生某些化學反應（疏水、共價）的速率不同，從而影響了其抗原性。干熱處理通過脫水干燥使蛋白質氧化、變性、炭化，相比于干熱處理，濕熱處理穿透性更強，更易于傳遞熱量，與水的直接接觸也更易破壞保持蛋白質穩定性的氫鍵等結構[23-24]。因此，濕熱處理更易使蛋白質變性并發生凝固，破壞蛋白化學結構，從而破壞過敏原的表位，降低蛋白致敏性。

高溫高壓處理是一種熱處理與非熱處理相結合的方式。高壓處理通過影響蛋白分子的非共價相互作用（氫鍵、離子鍵和疏水鍵）從而影響其二級和三級結構[25-27]。本研究發現，高溫高壓處理在降低核桃蛋白質量濃度和抗原性上均具有最顯著的效果，這提示高溫高壓處理能夠有效降低核桃蛋白致敏性。推測高溫高壓處理嚴重破壞了核桃中過敏原的原有結構和抗原表位，從而顯著降低了核桃過敏原的IgE、IgG結合能力，有效降低核桃蛋白抗原性。

此外，在本研究中還采用了微波加熱的處理方式，發現和干熱、濕熱、高溫高壓這3 種熱處理方式相比，微波加熱處理不但沒有降低核桃蛋白的可提取質量濃度，反而在一定程度上使其增加，這可能是因為微波作用可使核桃表里同時吸收微波能量，溫度升高，內部水分迅速汽化并向外遷移，形成無數條微小孔道，使樣品結構蓬松，增加其溶解度。此外，本研究還發現，微波處理略微提高了核桃蛋白的IgE、IgG結合能力，這可能是由于微波加熱的處理方式可以使蛋白的某些折疊結構被不同程度的打開，但由于加熱均勻，其表面溫度不高，不足以產生足夠的美拉德反應，因此會暴露或者形成更多的抗原表位，從而有利于抗體的結合，提高了核桃蛋白的抗原性。有研究指出，一些加工處理方式使蛋白形成新的穩定結構后，分子表面某些局部區域會形成新的抗原決定簇[28]，這可能也是本研究中微波加熱后核桃蛋白抗原性增強的原因。

值得注意是，在利用Western blot方法探究不同熱處理對核桃蛋白IgE結合能力的影響時，只在10～17 kDa以及20～30 kDa兩處發現結合條帶，尚未發現其他的結合條帶。這提示本研究中收集的核桃過敏患者血清只能夠識別這兩種核桃蛋白。目前，核桃過敏原蛋白已被鑒定的有Jug r 1、Jug r 2、Jug r 3、Jug r 4，本研究中第一個結合條帶根據分子質量可以推測為Jug r 1，而第二個結合條帶電泳遷移規律與已知的4 種核桃致敏原蛋白均不相符。說明本研究收集的核桃過敏患者血清只識別出了Jug r 1，并未識別出Jug r 2、Jug r 3、Jug r 4，這可能與收集的核桃患者血清相關。一方面可能由于本研究收集的血清樣本數量有限；另一方面，可能是由于在我國其他3 種核桃過敏原不是引起核桃過敏的主要過敏原。大量研究發現，食物過敏具有地區和人群差異性[29-31]，本研究結果進一步提示核桃過敏具有地區差異性，不同地區引起核桃過敏的過敏原可能不一樣。而本研究中發現的20～30 kDa處的結合條帶，推測是一種并未被鑒定的核桃過敏原，在核桃過敏中可能發揮重要作用，但這仍需要進一步研究；同時，由于本研究中采用的幾種熱處理方式均不能夠影響其抗原性，提示其結構相對穩定，具有較好的耐熱性。

綜上，濕熱和高溫高壓這兩種熱處理方式不僅能夠顯著降低核桃蛋白質量濃度，同時還能顯著降低核桃蛋白抗原性，這提示濕熱和高溫高壓這兩種熱處理方式能夠有效降低核桃蛋白致敏性，其中高溫高壓處理的效果最為顯著。本研究的結果為尋找降低核桃蛋白致敏性的加工方式提供了參考，同時也為其他堅果類食品降低致敏性的加工方法提供借鑒。