不同來源乳鐵蛋白及乳鐵蛋白素對小鼠脾淋巴細胞增殖影響的比較

皮冰冰，趙 曉，呂萍萍，彭鈺凱，潘 琳，許曉曦,

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.綏芬河出入境檢驗檢疫局，黑龍江 綏芬河 157300）

嬰兒配方奶粉作為一種母乳替代品[1]，是非母乳喂養嬰兒的首選食物。嬰幼兒配方奶粉的研制，從宏觀到微觀都要求盡可能地接近人乳。目前配方奶粉在營養成分上已滿足嬰幼兒的生長需要[2-4]，但其中缺少能夠提高嬰幼兒免疫能力的免疫活性物質[5-6]。人乳鐵蛋白（human lactoferrin，LFH）作為母乳中重要的免疫活性成分，是人乳中主要的蛋白質之一，占普通母乳總蛋白含量的10%[7-8]，是嬰兒增強免疫系統能力的重要物質[9-10]，是嬰兒配方奶粉“母乳化”的重要指標。乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）經胃蛋白酶作用會釋放生物活性物質乳鐵蛋白素（lactoferricin，Lfcin）。研究表明，LF與Lfcin在抵抗真菌、炎癥以及病菌感染[11-13]，抗癌及提高機體的免疫調節能力促進傷口愈合[14-16]等方面具有顯著作用。現階段包括我國在內的許多國家均已將LF加到嬰兒配方奶粉中[16-17]，但用量不明確[18-19]，且LFH來源受限，價格昂貴，限制了其的添加使用。牛乳鐵蛋白（bovine lactoferrin，LFB）分子質量與LFH分子質量相近[20-21]，且牛乳鐵蛋白素（bovine lactoferricin，LfcinB）與人乳鐵蛋白素（human lactoferricin，LfcinH）的順序同源性高達69%[22-23]，LFB原料來源便捷、價廉，尤其是小肽LfcinB的生產更節約成本。如何以低價等效成分替代母乳活性成分，對于降低嬰兒配方奶粉中免疫活性物質的成本具有重要的意義。本研究以牛乳清乳鐵蛋白（bovine whey lactoferrin，LFW）、牛初乳乳鐵蛋白（bovine colostrum lactoferrin，LFC）與LFH及LfcinB與LfcinH為原料，探究其作用的最佳劑量及相互替代的用量比例關系，為LFB替代LFH在配方奶粉中的添加提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

BALB/c小鼠SPF級雌性6～8 周，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。LFW（產自新西蘭） 北京銀河路經貿有限公司；LFC 黑龍江康普生物科技有限公司；LFH 西安百川生物科技有限公司；LfcinB（氨基酸序列FKCRR WQWRM KKLGA PSITC VRRAF）、LfcinH（氨基酸序列GRRRR SVQWC AVSQP EATKC FQWQR NMRKV RGPPV SCIKR DSPIQ CIQA） 瀚海博興生物技術有限公司。

RPMI-1640完全培養基 美國HyClone公司；胎牛血清 德國BI公司；雙抗（青霉素和鏈霉素）、紅細胞裂解液、L-谷氨酰胺 Solarbio生物科技有限公司；磷酸脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、刀豆蛋白（concanavalin A，ConA） 美國Sigma公司；CCK-8試劑盒 南京建成生物工程研究所；其余化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HF90型CO2培養箱 北京市六一儀器廠；BPG-9070A鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；MHBS-1096A酶標儀 南京DeTie公司；AE-31型倒置顯微鏡 麥克奧迪實業集團有限公司；DSX-280B高壓滅菌鍋 上海申安公司；血球計數板 上海求精生化試劑儀器有限公司；3K15高速冷凍離心機 德國Sigma公司；BSA224S分析天平、PB-10 pH計 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠脾淋巴細胞的制備

將斷糧12 h的小鼠脫頸處死，在體積分數75%乙醇溶液中浸泡15 min。將雙手及超凈無菌臺面用體積分數75%乙醇溶液消毒，并用鑷子將小鼠轉移至解剖盤中。吸取10 mL無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）注入干凈無菌培養皿中，用解剖剪剪開小鼠胸腔，取出脾臟置于PBS中，清除脂肪及筋膜組織，并用PBS淋洗1～2 次，放入盛有5 mL無菌PBS的離心管中，密封好帶入細胞培養室[24-25]。用體積分數75%乙醇溶液擦拭雙手及超凈無菌臺面，吸取10 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養基注入無菌培養皿中，除去裝有脾臟的離心管中的PBS，將小鼠脾臟轉移至培養皿中，用1 mL無菌注射器吸滿培養基，用針頭在不刺穿脾臟的前提下沖洗并擠壓小鼠脾臟，收集此時的脾細胞懸液到離心管中，用培養基沖洗培養皿1～2 次，同樣收集至離心管中，1 500 r/min離心5 min后，倒掉上清液，加入約4 倍體積的紅細胞裂解液并吹打細胞使其懸浮后靜置5 min后加入等量的PBS，1 500 r/min離心5 min以除去血紅細胞（若效果不夠理想可再次重復操作），再用培養基洗滌細胞2 次[26-27]。將上述收集到的脾細胞置于裝有15 mL完全培養基的培養瓶中，至于37 ℃含5% CO2的培養箱中培養4 h，除去其中所含的貼壁細胞，用血球計數板計算細胞數量待用。

1.3.2 LF及Lfcin對淋巴細胞增殖的影響

將LFW、LFC、LFH用含10%胎牛血清的完全RPMI-1640培養基配制的質量濃度為0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL的LF溶液，LfcinB與LfcinH用含10%胎牛血清的完全RPMI-1640培養基配制的質量濃度為50、75、100、125、150 μg/mL的Lfcin溶液，0.22 μL濾膜過濾備用。

將1.3.1節獲得的細胞濃度調至1×106個/mL，以每孔100 μL接種到96 孔培養板中。LF實驗組：細胞懸液中加入LF溶液；Lfcin實驗組：細胞懸液中加入Lfcin溶液；同時設陽性對照組：細胞懸液中加入等量的質量濃度為5 μg/mL的ConA；陰性對照組：細胞懸液中只加入含10%的完全RPMI-1640培養基，添加量均為20 μL；空白組：每孔無細胞懸液，只含等量120 μL的RPMI-1640完全培養基。每一質量濃度設3 個復孔，置于37 ℃含5% CO2培養箱中培養24、48、72 h后，每孔避光加入10 μL CCK-8試劑[28-29]，置于37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養3～4 h，在酶標儀450 nm波長處振蕩60 s測定OD值，比較各組OD值來判斷處理細胞的最佳質量濃度及最佳時間。根據下式計算細胞相對存活率[30]。

1.3.3 LF及Lfcin在ConA刺激下對T淋巴細胞增殖的影響

將1.3.1節獲得的細胞濃度調至1×106個/mL，然后接種到96 孔板中，每孔100 μL。LF＋ConA實驗組：細胞懸液中加入LF溶液20 μL及5 μg/mL的ConA溶液20 μL；Lfcin＋ConA實驗組：細胞懸液中加入配制的Lfcin溶液20 μL及5 μg/mL的Con A溶液20 μL；同時設對照組：細胞懸液中只加入等量含10%的完全RPMI-1640培養基及5 μg/mL ConA；空白組：每孔無細胞懸液、只含等量的RPMI-1640完全培養基。每一質量濃度設3 個復孔，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h后，每孔避光加入10 μL CCK-8試劑，置于37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養3～4 h，在酶標儀450 nm波長處振蕩1 min測定OD值，比較各組OD值來判斷處理細胞的最佳質量濃度。

1.3.4 LF及Lfcin在LPS刺激下對B 淋巴細胞增殖的影響

將上述1.3.1節獲得的細胞濃度調至1×106個/mL，以每孔100 μL接種到96 孔板中。LF＋LPS實驗組：細胞懸液中加入配制的LF溶液20 μL及1 μg/mL的LPS溶液20 μL；Lfcin＋LPS實驗組：細胞懸液中加入配制的Lfcin溶液20 μL及5 μg/mL的LPS溶液20 μL；同時設對照組：細胞懸液中只加入等量含10%的完全RPMI-1640培養基及1 μg/mL LPS；空白組：無細胞懸液、只含等量的140 μL完全培養基。每一質量濃度設3 個復孔，37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h后，每孔避光加入10 μL CCK-8試劑，繼續在培養箱中培養3～4 h，在酶標儀450 nm波長處振蕩60 s測定OD值，比較各組OD值來判斷處理細胞的最佳質量濃度。

1.4 數據統計分析

每組實驗重復3 次。數據均使用SPSS 19.0軟件進行統計分析，單因素方差分析法比較差異顯著性，并用Sigma Plot 12.5軟件作圖，結果以 ±s表示。

2 結果與分析

2.1 LF及Lfcin對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

2.1.1 LF對小鼠脾淋巴細胞相對存活率的影響

表1 不同來源LF作用24 h后的淋巴細胞相對存活率Table1 Relative survival rates of lymphocytes after 24 h culture in the presence of LF from different sources%

由表1可知，在24 h時，4.00 mg/mL LFW及4.00 mg/mL LFH與陰性對照組相比顯著性差異（P＜0.05）。由表1中細胞相對存活率可知，LFW對淋巴細胞的增殖效果相對高于其他兩種LF，其他兩種LF對細胞增殖既有促進作用也有抑制作用，但促進效果低于LFW的促進效果。

表2 不同來源LF作用48 h后的淋巴細胞相對存活率Table2 Relative survival rates of lymphocytes after 48 h culture in the presence of LF from different sources%

由表2可以看出，在48 h時，1.00、2.00 mg/mL的LFC及1.00、2.00、4.00 mg/mL的LFH與陰性對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。由表2中細胞相對存活率可知，LF在48 h時作用效果隨質量濃度增大呈先增強后下降的趨勢，LFW的作用效果隨時間及質量濃度的變化波動較小。

表3 不同來源LF作用72 h后的淋巴細胞相對存活率Table3 Relative survival rates of lymphocytes after 72 h culture in the presence LF from different sources%

由表3可以看出，在72 h時，0.50、1.00、4.00 mg/mL LFC及1.00、2.00、4.00 mg/mL LFH與陰性對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。由表3中細胞相對存活率可知，LF在72 h時3 種LF對細胞的增殖作用效果無明顯規律。

由表1～3可以看出，在不同時間內不同來源的LF對淋巴細胞的作用程度不同，3 種LF在48 h的細胞相對存活率較高。表2顯示，LF在48 h時作用效果隨質量濃度增大整體呈先增強后下降的趨勢，LFW的作用效果隨時間及質量濃度的變化波動較小。LFH在1.00 mg/mL時對淋巴細胞增殖的促進作用效果最高，而LFC在2.00 mg/mL時效果與其最為接近。結果表明，LFH的最佳質量濃度為1.00 mg/mL，與細胞的添加比例為1∶5，LFC對細胞的增殖作用可替代LFH的作用效果，替代質量濃度約為LFH的2 倍。

2.1.2 Lfcin對小鼠脾淋巴細胞相對存活率的影響

表4 不同來源Lfcin作用24、48、72 h后的小鼠脾淋巴細胞相對存活率Table4 Relative survival rates of lymphocytes after 24, 48 and 72 h in the presence of LF from different sources%

由表4可以看出，在24 h時，LfcinB及LfcinH與陰性對照組相比顯著性不差異（P＜0.05），但均在100 μg/mL時細胞相對存活率達到最大。在48 h時，75～150 μg/mL LfcinB及100 μg/mL LfcinH與陰性對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。LfcinH的最佳效果高于LfcinB的最佳效果。在72 h時，100 μg/mL LfcinH與對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。由細胞存活率可知，LfcinH的效果整體優于LfcinB的作用效果。

不同時間內LfcinB和LfcinH處理的淋巴細胞的存活率隨質量濃度的升高均表現為先升高再降低的趨勢，并且48 h是促進細胞增殖的最佳時間。表4中48 h的相對存活率顯示，LfcinB對淋巴細胞的促進作用在125 μg/mL時達到最大，而LfcinH在100 μg/mL時達到最大，且效果優于LfcinB的最大效果。結果表明，LfcinH的最佳添加質量濃度為100 μg/mL，與細胞的添加比例為1∶5，LfcinB對細胞的增殖作用可替代LfcinH的作用效果，替代效果略差。

由表1～4可知，Lfcin與LF都在最大促進作用效果時LFH的添加用量約為LfcinH的10 倍，而LFB的添加量約為LfcinB的16 倍，來源于牛乳與人乳的LF及Lfcin均可增強免疫淋巴細胞的存活率，且來源于人的LF及Lfcin對淋巴細胞存活的促進效果高于來源于牛的LF及Lfcin，其中來源于牛乳的LFC作用效果大于LFW，并且使用Lfcin可大大降低使用劑量。

2.2 LF與Lfcin在ConA刺激下對T脾淋巴細胞增殖的影響

圖1 LF與Con A共同作用48 h對小鼠脾淋巴細胞增殖作用的影響Fig. 1 Effects of lactoferrin combined with ConA on the proliferation of spleen lymphocyte after 48 h culture

由圖1可以看出，LF與在ConA的刺激下培養細胞48 h后，淋巴細胞的相對存活率均先升高后下降。LFW在0.10～4.00 mg/mL范圍內對ConA刺激的淋巴細胞的增殖能力均為促進作用，在0.50 mg/mL達到最大效果，但整體效果差異較小。LFC與LFH在0.10 mg/mL時抑制ConA刺激的淋巴細胞增殖，在0.25～4.00 mg/mL范圍內促進ConA刺激的淋巴細胞增殖，LFC在1.00 mg/mL時達到最大效果，LFH在0.50 mg/mL時達到最大效果，LFC高于其他兩種LF的最佳效果。結果表明，兩種LFB可在最大效果0.50 mg/mL處替代LFH的作用，且增加LFC的劑量可以達到更佳的效果。

圖2 Lfcin與ConA 共同作用48 h對小鼠脾淋巴細胞增殖作用的影響Fig. 2 Effects of Lfcin combined with ConA on the proliferation of spleen lymphocyte after 48 h culture

由圖2可知，Lfcin在與ConA的刺激下培養細胞48 h后，小鼠的免疫淋巴細胞的相對存活率均隨著Lfcin質量濃度的增加而先升高后下降。LfcinB在75 μg/mL時作用效果達到最高，此質量濃度LfcinH的作用效果與LfcinB的作用效果基本持平，而LfcinH在100 μg/mL時作用效果達到最高。結果表明，在與ConA共同按1∶1作用淋巴細胞時，LfcinB與LfcinH的最佳添加質量濃度分別為75、100 μg/mL，按1∶5作用細胞懸液，但加大劑量會加強LfcinH的作用效果，LfcinB對細胞的增殖作用可替代LfcinH的作用效果，替代效果略差。

圖1、2結果顯示，Lfcin與LF都在最大促進作用效果時LFH的添加用量約為LfcinH的5 倍，而LFB的添加量約為LfcinB的13 倍。LFH與ConA共同作用的最佳使用質量濃度為0.50 mg/mL，此作用效果可用同質量濃度的LFW與LFC替代，且將LFC的劑量提高一倍所得效果遠遠高于LFH的作用效果。由此表明，來源于牛乳的LF及Lfcin可替代來源于人乳的LF及Lfcin對免疫淋巴細胞存活率的影響作用，并且使用Lfcin可大大降低使用劑量。

2.3 LF與Lfcin在LPS刺激下對B脾淋巴細胞增殖的影響

圖3 LF與 LPS 共同作用48 h對小鼠脾淋巴細胞增殖作用的影響Fig. 3 Effects of lactoferrin combined with LPS on the proliferation of spleen lymphocyte after 48 h culture

由圖3可知，LF與LPS對免疫淋巴細胞協同刺激作用后，增強效果隨質量濃度的提高先升高后降低，LFH在0.50～4.00 mg/mL范圍內效果波動不明顯，并在2.00 mg/mL時達到最大效果。LFW與LFC分別在0.50 mg/mL與2.00 mg/mL時可近似達到LFH的最大效果。結果表明，在與等量的LPS共同作用下，LFH的最佳添加質量濃度為2.00 mg/mL，與細胞的添加比例為1∶5，LFW與LFC質量濃度分別為0.50 mg/mL與2.00 mg/mL時對細胞的增殖作用可替代LFH的作用效果，替代效果略差。

圖4 Lfcin與LPS 共同作用48 h對小鼠脾淋巴細胞增殖作用的影響Fig. 4 Effects of Lfcin combined with LPS on the proliferation of spleen lymphocyte after 48 h culture

由圖4可知，在分別與LPS按1∶1比例的共同作用下，50～100 μg/mL LfcinB與LfcinH對淋巴細胞均具有促進增殖的作用，且均呈先升高后下降的趨勢。且LfcinH與LfcinB均在100 μg/mL時對淋巴細胞的增殖促進效果最佳。結果表明，LfcinB可替代LfcinH對免疫淋巴細胞增殖的促進作用，但替代效果略差。

圖3、4結果顯示，在絲裂原LPS的作用下，Lfcin與LF都在最大促進作用效果時LFH的添加用量約為LfcinH的20 倍，而LFW的添加量約為LfcinB的5 倍，LFC的添加量約為LfcinB的20 倍，且來源于人乳的LF及Lfcin對淋巴細胞存活的促進效果略高于來源于牛乳的LF及Lfcin，由此表明來源于牛乳的LF及Lfcin可替代來源于人乳的LF及Lfcin對免疫淋巴細胞存活率的影響作用，并且使用Lfcin可大大降低使用劑量。

3 結 論

本實驗以體外分離培養的脾淋巴細胞作為細胞模型，對比LFW、LFC、LFH、LfcinB和LfcinH對其增殖作用的差異及相關性。研究發現在相同用量的前提下，3 種LF及兩種Lfcin在一定質量濃度范圍內能有效地促進脾淋巴細胞增殖，同一質量濃度的LF或Lfcin其促進效果會隨作用時間的延長而有所改變。LFW、LFC、LFH與ConA、LPS對T、B淋巴細胞增殖刺激作用與質量濃度有關，LfcinB、LfcinH與ConA、LPS對T、B淋巴細胞增殖有協同刺激作用，且隨著質量濃度增加，協同作用增強。

根據LF單獨作用及在分裂刺激源ConA與LPS共同作用免疫淋巴細胞對其增殖作用顯示的最佳添加質量濃度可知，在3 種不同作用條件下LFH在0.50～2.00 mg/mL范圍內對免疫淋巴細胞的促進效果最好，而LFW與LFC在此范圍內可替代LFH的作用效果，且LFC效果更接近。LfcinH在3 種條件下在100 μg/mL時對免疫淋巴細胞的促進效果最好，而LfcinB在75～125 μg/mL范圍內效果相對最優，在此質量濃度范圍內LfcinB可替代LfcinH的作用效果。3 種LF與兩種Lfcin的最大作用效果差距較小，說明Lfcin是LF發揮免疫提高功效的主要部分。LFW與LFC在提高免疫方面能達到LFH的作用效果，進一步說明兩種LFB可替代LFH應用于嬰兒配方產品中以提高嬰幼兒免疫能力，推薦添加質量濃度為0.50～2.00 mg/mL，其中LFC的替代效果高于LFW的作用效果，此質量濃度可充分發揮LF的免疫增強能力。并且Lfcin推薦添加質量濃度為75～125 μg/mL，用相應的Lfcin替代LF可大大降低用量。