羊肚菌菌絲體鋅多糖的體內(nèi)、體外抗氧化作用

冮 潔，王 艷，李佳桐，范麗娟，曹 蕾，龐士磊，劉文玲，陳濤濤

（大連民族大學(xué) 生物技術(shù)與資源利用教育部重點實驗室，遼寧 大連 116600）

鋅是人體必需的微量元素，能促進(jìn)人體生長發(fā)育和增強人體免疫機能[1]。全球近1/3的人口面臨著缺鋅引起的健康問題，缺鋅已成為影響人類健康的主要因素之一[2]。在我國，約50%的兒童表現(xiàn)出輕微的缺鋅癥狀，而在以谷類作物為主食的北方尤其是偏遠(yuǎn)地區(qū)，這種情況更為嚴(yán)重。鋅有“兒童生長素”之稱，缺鋅可致免疫力低下、佝僂病、貧血、營養(yǎng)不良及反復(fù)呼吸道感染，不同程度影響兒童生長發(fā)育[3-4]，甚至導(dǎo)致出現(xiàn)異食癖[5]。食用菌具有較強的富鋅能力，通過將鋅攝入食用菌菌絲細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行物質(zhì)代謝轉(zhuǎn)化，將無機鋅結(jié)合到大分子活性物質(zhì)（如多糖和蛋白質(zhì)）上，形成有機鋅多糖和鋅蛋白，可以避免無機鋅的缺點，并更有利于有機鋅的免疫功能和食藥用菌的抗病功能的發(fā)揮[6]。鋅多糖作為第三代的補鋅產(chǎn)品，能被人體更高效、更安全地吸收利用。鋅多糖具有抗氧化的功效，陳宏偉等[7]研究蛹蟲草胞外鋅多糖的抗氧化能力時發(fā)現(xiàn)鋅多糖對超氧陰離子自由基（）、羥自由基（?OH）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除能力與空白對照組相比分別提高了7.05%、23.50%和17.49%，胞外鋅多糖對自由基的清除能力與多糖質(zhì)量濃度呈正向關(guān)系，實驗證明鋅多糖具有明顯的抗氧化功效。李正鵬等[8]研究發(fā)現(xiàn)，樹舌胞外鋅多糖質(zhì)量濃度達(dá)到2.5 g/L時，對油脂過氧化物的抑制、?OH的清除、DPPH自由基和?的清除能力比對照組分別提高了12.50%、26.83%、30.00%、20.00%，胞外鋅多糖抗氧化活性與多糖質(zhì)量濃度呈顯著的量效關(guān)系。劉芳[9]在研究金針菇中的鋅多糖抗氧化活性時發(fā)現(xiàn)，多糖質(zhì)量濃度相同的條件下，鋅含量與抗氧化活性有一定的正相關(guān)性。目前，研究較多是鋅多糖體外抗氧化活性，對體內(nèi)抗氧化活性研究的較少。羊肚菌（Morchella esculenta），是一種名貴的大型食藥兼用真菌，羊肚菌多糖是其主要的活性成分之一，能夠保護肝臟損傷[10]、延緩細(xì)胞衰老[11]、減少脂褐質(zhì)的沉積[12]，對胃潰瘍[13]和胃黏膜有保護作用[14]，對輻射危害有輔助保護功能[15]，具有抗氧化、抗炎癥和抗腫瘤的作用[16-18]。目前，羊肚菌沒有實現(xiàn)大規(guī)模人工栽培[19]，主要采用菌絲體的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法[20]，適合生產(chǎn)的工業(yè)化，且深層液體發(fā)酵培養(yǎng)的食用菌菌絲體與其子實體在化學(xué)組成、生理功能上都很相似[21]。液態(tài)培養(yǎng)提取出的羊肚菌胞外多糖有較明顯的抑制腫瘤、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[22-23]。本課題組在已經(jīng)研究了羊肚菌菌絲體液體富鋅條件[24]和羊肚菌菌絲體硒多糖抗氧化活性的基礎(chǔ)上[25]，對羊肚菌菌絲體鋅多糖體內(nèi)、外抗氧化性進(jìn)行了研究，以期闡明羊肚菌菌絲體鋅多糖抗氧化、抗衰老的功效，為食用菌鋅多糖的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

昆明種小鼠，雄性，（15±2）g，5～6 周齡，由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。羊肚菌（M. esculenta）菌種由遼寧朝陽食用菌研究所提供。

DPPH、氮藍(lán)四唑、二硫蘇糖醇 美國Sigma-Aldirch公司；乙二胺四乙酸、Tris-HCl、硫酸亞鐵銨、鄰二氮菲、VC、鄰苯三酚、D-半乳糖、乙醇、HNO3、苯酚、硫酸、核黃素、聚乙烯吡咯烷酮、H2O2、硫代巴比妥酸等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Z-2000火焰原子吸收光譜儀 日本日立公司；BS223S精密電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；ZHJH-C2112B超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；UV-2000紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；HYG-3多功能搖床 金壇市杰瑞爾電器有限公司；GRP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司；MLS-3750高壓滅菌鍋 日本三洋公司；TDZ5-WS離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羊肚菌菌絲體液體培養(yǎng)

斜面培養(yǎng)基（綜合PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO41.5 g、MgSO41.0 g、瓊脂粉20 g、水1 000 mL，pH值自然。菌種液體發(fā)酵采用不加瓊脂的綜合PDA培養(yǎng)基。

菌種活化：將保存菌種用接種針接入斜面培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。

菌種液體培養(yǎng)：將活化的斜面菌種4 塊（黃豆粒大?。┙臃N到裝有100 mL液體PDA綜合培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，25 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)5 d。

菌絲體液體培養(yǎng)：將PDA液體培養(yǎng)基中的菌液按體積分?jǐn)?shù)10%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)5～7 d。發(fā)酵培養(yǎng)液5 000 r/min離心20 min，菌絲沉淀用蒸餾水洗滌3 次，菌絲體60 ℃干燥，測定其菌絲體多糖含量和鋅含量。富鋅組在培養(yǎng)基中加入600 mg/L硫酸鋅。不加鋅的為空白組。

1.3.2 多糖的提取及測定

采用熱水浸提法提取菌絲體多糖，料液比為1∶10（m/V），80 ℃水浴3 h，水浴浸提后過濾，濾液濃縮，加入無水乙醇溶液使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，靜置于4 ℃冰箱內(nèi)醇沉12 h。取出后5 000 r/min離心15 min，沉淀用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液重復(fù)洗滌3 次，然后60 ℃干燥。

多糖含量的測定：采用苯酚-硫酸比色法[26]。菌絲體鋅含量的測定：采用微波消解-火焰原子吸收光譜法測定，富鋅率根據(jù)式（1）計算[24]。

式中：w為富鋅菌絲體鋅含量/（μg/g）；w0為空白菌絲體鋅含量/（μg/g）；ρ為培養(yǎng)基內(nèi)富鋅菌絲體質(zhì)量濃度/（μg/100 mL）；ρ0為培養(yǎng)基內(nèi)鋅質(zhì)量濃度/（μg/100 mL）。

1.3.3 體外抗氧化性實驗

1.3.4 體內(nèi)抗氧化實驗

小鼠10 只為一組，正常飼養(yǎng)的為空白組；用每天腹腔注射D-半乳糖（100 mg/（kg?d））誘導(dǎo)致衰老小鼠作對照組；將羊肚菌菌絲體多糖溶于小鼠飲用水中，以每只小鼠飲用量為320 mg/（kg?d）進(jìn)行喂養(yǎng)，喂養(yǎng)羊肚菌菌絲體多糖組小鼠為實驗多糖組，喂養(yǎng)羊肚菌菌絲體鋅多糖組小鼠為實驗富鋅組。小鼠喂養(yǎng)條件：自然晝夜，節(jié)律光照，溫度（18±5）℃，相對濕度40%～60%。自然采食，連續(xù)喂養(yǎng)30 d后，空腹12 h期間只供給飲水，之后摘除眼球取血，4 ℃、3 000 r/min離心10 min取血清，－20 ℃保存待用。脫臼處死，取肝和腎，用生理鹽水清洗，勻漿，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液，－20 ℃保存待用。

1.3.5 抗氧化酶活力和MDA含量的測定

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力采用氮藍(lán)四唑光化還原法測定[27]；過氧化氫酶（catalase，CAT）活力測定采用紫外分光光度法[28]；丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測定采用硫代巴比妥酸比色法[29]。

1.3.6 小鼠臟器系數(shù)

臟器系數(shù)根據(jù)式（2）計算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌菌絲體多糖提取及富鋅率

采用液體深層發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行羊肚菌菌絲體富鋅培養(yǎng)，其菌絲體多糖提取和富鋅率計算結(jié)果如表1所示。

表1 羊肚菌菌絲體多糖提取結(jié)果和富鋅率Table1 Extraction yield and zinc enrichment percentage of polysaccharides from Morchella esculenta mycelium

由表1可知，羊肚菌菌絲體不加鋅培養(yǎng)，菌絲體中多糖含量為641.10 mg/g；而添加了鋅源培養(yǎng)的菌絲體中多糖含量為695.40 mg/g。說明添加鋅能促進(jìn)羊肚菌菌絲體多糖的合成。羊肚菌菌絲體具有較強的富鋅能力，富鋅率可達(dá)18.20%，提取的粗多糖中鋅含量可達(dá)0.860 mg/g。

2.2 羊肚菌菌絲體多糖體外抗氧化作用

2.2.1 羊肚菌菌絲體多糖?OH清除率

圖1 羊肚菌菌絲體多糖對?OH清除率Fig. 1 Scavenging effect of mycelial polysaccharides from Morchella esculenta mycelium on hydroxyl free radicals

通過測定VC、羊肚菌菌絲體鋅多糖和沒添加鋅源的菌絲體多糖對鄰苯三酚的自氧化抑制作用來表明它們清除活性，結(jié)果如圖2所示。

圖2 羊肚菌菌絲體多糖對?的清除率Fig. 2 Scavenging effect of mycelial polysaccharides from Morchella esculenta mycelium on superoxide anion free radicals

0.48 mg/mL；未加鋅的羊肚菌菌絲體多糖的回歸方程為y＝70.5x＋6.77（R2＝0.991），IC50為0.61 mg/mL；VC的回歸方程為y＝79.835x＋19.544（R2＝0.986 1），IC50為0.38 mg/mL。對?清除作用大小為：VC＞羊肚菌菌絲體鋅多糖＞羊肚菌菌絲體多糖。羊肚菌菌絲體鋅多糖清除活性比羊肚菌菌絲體多糖提高27.08%。

2.2.3 羊肚菌菌絲體多糖DPPH自由基清除率

圖3 羊肚菌菌絲體多糖對DPPH自由基的清除率Fig. 3 Scavenging effect of mycelial polysaccharides from Morchella esculenta mycelium on DPPH free radicals

由圖3可得，羊肚菌菌絲體鋅多糖清除DPPH自由基的回歸方程為y＝36.47x＋28.317（R2＝0.988 1），IC50為0.59 mg/mL；未加鋅的羊肚菌菌絲體多糖的回歸方程為y＝49.415x＋16.792（R2＝0.993），IC50為0.67 mg/mL；VC的回歸方程為y＝67.51x＋34.876（R2＝0.970 1），IC50為0.22 mg/mL。對DPPH自由基清除作用大小為：VC＞羊肚菌菌絲體鋅多糖＞羊肚菌菌絲體多糖。羊肚菌菌絲體鋅多糖清除DPPH自由基活性比羊肚菌菌絲體多糖提高13.56%。

2.3 羊肚菌菌絲體多糖體內(nèi)抗氧化作用

2.3.1 羊肚菌菌絲體多糖對小鼠臟器系數(shù)的影響

表2 羊肚菌菌絲體多糖對小鼠臟器系數(shù)的影響Table2 Effect of mycelial polysaccharides from Morchella esculenta mycelium on visceral organ indices in mice

對照組小鼠臟器系數(shù)變小，說明小鼠臟器發(fā)生萎縮或其他退行性改變，即小鼠衰老模型建模成功。羊肚菌菌絲體多糖組和羊肚菌菌絲體鋅多糖組小鼠臟器系數(shù)均大于對照組，說明羊肚菌菌絲體多糖和羊肚菌菌絲體鋅多糖對衰老小鼠臟器萎縮均有抑制作用，羊肚菌菌絲體鋅多糖的抑制作用更強。

2.3.2 羊肚菌菌絲體多糖對小鼠體內(nèi)SOD活力的影響

由表3可見，羊肚菌菌絲體多糖組、羊肚菌菌絲體鋅多糖組和對照組小鼠SOD活力具有顯著性差異（P＜0.05），其中以肝臟最為顯著。與對照組相比，羊肚菌菌絲體鋅多糖使肝臟中SOD活力提高51.52%、血清SOD活力提高16.65%、腎臟SOD活力提高6.43%；未富鋅的羊肚菌菌絲體多糖使肝臟中SOD活力提高38.60%、血清SOD活力提高12.09%、腎臟SOD活力提高4.08%。羊肚菌多糖組小鼠體內(nèi)的SOD活力明顯高于對照組，羊肚菌多糖可明顯提高SOD活力，從而達(dá)到抗氧化作用。而羊肚菌鋅多糖組小鼠體內(nèi)的SOD活力與羊肚菌菌絲體多糖組小鼠體內(nèi)的SOD活力具有顯著性差異，說明羊肚菌鋅多糖抗衰老效果更佳。

表3 羊肚菌菌絲體多糖對小鼠體內(nèi)SOD活力的影響Table3 Effect of mycelial polysaccharides from Morchella esculenta mycelium on SOD activity in mice U/mg

2.3.3 羊肚菌菌絲體多糖對小鼠體內(nèi)CAT活力的影響

表4 羊肚菌菌絲體多糖對小鼠體內(nèi)CAT活力的影響Table4 Effect of mycelial polysaccharides from Morchella esculenta mycelium on catalase activity in mice

表4結(jié)果表明，小鼠肝臟中，羊肚菌菌絲體多糖組和對照組無明顯差異，但羊肚菌菌絲體鋅多糖組與對照組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。羊肚菌菌絲體鋅多糖使肝臟中CAT活力提高81.08%，腎臟CAT活力提高75.56%；未富鋅的羊肚菌菌絲體多糖使肝臟中CAT活力提高32.43%，腎臟CAT活力提高42.22%。羊肚菌菌絲體多糖可明顯提高小鼠體內(nèi)CAT活力，而羊肚菌菌絲體鋅多糖組小鼠體內(nèi)的CAT活力明顯高于羊肚菌多糖組，說明羊肚菌菌絲體鋅多糖抗衰老效果更佳。多糖通過提高機體內(nèi)SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶等的活力，間接清除自由基[25]。

2.3.4 羊肚菌菌絲體多糖對小鼠體內(nèi)MDA含量的影響

表5結(jié)果表明，羊肚菌菌絲體多糖組、羊肚菌菌絲體鋅多糖組和對照組小鼠MDA具有顯著性差異（P＜0.05），其中以肝臟最為顯著。羊肚菌菌絲體鋅多糖使肝臟中MDA含量下降58.50%，血清MDA含量下降44.57%，腎臟MDA含量下降76.69%；未富鋅的羊肚菌菌絲體多糖使肝臟中MDA含量下降20.86%，血清MDA含量下降29.03%，腎臟MDA含量下降46.63%。羊肚菌菌絲體多糖組小鼠體內(nèi)的MDA含量明顯低于對照組，說明羊肚菌多糖可明顯減少小鼠體內(nèi)MDA含量，從而達(dá)到抗氧化作用。而羊肚菌鋅多糖組小鼠體內(nèi)的MDA含量與羊肚菌菌絲體多糖組也有顯著性差異，說明羊肚菌菌絲體鋅多糖抗衰老效果更佳。

表5 羊肚菌菌絲體多糖對小鼠體內(nèi)MDA含量的影響Table5 Effect of mycelial polysaccharides from Morchella esculenta mycelium on MDA content in mice nmol/mg

3 結(jié) 論

羊肚菌菌絲體具有較強的富鋅能力，通過液體深層培養(yǎng)其菌絲體富鋅率可達(dá)18.20%，提取的粗多糖中鋅含量可達(dá)0.86 mg/g。清除?OH、和DPPH自由基的實驗結(jié)果證明了羊肚菌菌絲體多糖具有較強的體外抗氧化性，而通過富鋅培養(yǎng)獲得的羊肚菌菌絲體鋅多糖比羊肚菌菌絲體多糖具有更強的體外抗氧化活性。羊肚菌菌絲體多糖和羊肚菌富鋅菌絲體多糖能夠顯著提高D-半乳糖致衰老小鼠肝臟、腎臟和血清中的SOD和CAT活力，降低MDA含量（P＜0.05）。并且，羊肚菌菌絲體鋅多糖比羊肚菌菌絲體多糖具有更強的抗衰老作用。