山慈菇多糖的免疫調節作用及對小鼠骨肉瘤細胞S180體內生長抑制作用

姜 爽，徐婧瑤，蘇 鑫，劉 智，宋 伍,

（1.長春中醫藥大學基礎醫學院，吉林 長春 130117；2.長春中醫藥大學附屬醫院，吉林 長春 130021）

山慈菇為藥食同源植物，是蘭科植物獨蒜蘭、云南獨蒜蘭或杜鵑蘭的干燥假鱗莖，其味甘、微辛、性寒，歸肝、脾經，具有化痰散結、清熱解毒之功效[1]。現代藥學研究表明，山慈菇的主要活性成分包括聯芐類、菲類、黃烷類、木脂素類及苷類，其藥理作用涉及抗腫瘤、抗菌、降壓、抗血管生成及對乙酰膽堿受體M3的阻斷作用等[2]。關于山慈菇多糖（Pseudobulbus cremastrae seu pleiones polysaccharide，PCSPP）的活性研究較少，有研究表明，PCSPP具有抑制荷H22肝癌小鼠的腫瘤生長作用，該作用與其使Bcl-2表達減少進而促進腫瘤細胞凋亡有關[3]。在多種植物多糖的免疫調節及抗腫瘤作用已被證實[4-7]，傳統中醫多應用山慈菇水提取物治療癌癥，本研究將著重探討PCSPP的免疫調節及抑制小鼠骨肉瘤細胞S180在體內生長的作用，為進一步研究和開發PCSPP提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

C57BL/6J小鼠，18～22 g，購于北京維通利華公司，雌雄各半，許可證號：SCXK（京）2014-0016。

小鼠骨肉瘤細胞S180購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，并定期進行腹腔接種傳代。

PCSPP（純度＞85%，批號：20140706） 西安一文生物科技有限公司；小牛血清 杭州四季青生物工程材料研究所；環磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）、刀豆蛋白（concanavalin A，Con A）、細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 美國Sigma公司；抗小鼠CD4＋（FITC標記）和CD8＋（PE標記）抗體 美國eBioscience公司；白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）檢測試劑盒 北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

680型酶標儀 美國Bio-Rad公司；BCM-1000型生物潔凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設備公司；FA1004N型電子天平 上海精天電子儀器廠；TGL-16G型低溫臺式高速離心機 上海安亭科學儀器廠；FACS Calibur型流式細胞儀 美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠脾淋巴細胞增殖檢測

取正常小鼠，頸椎脫臼法處死后，無菌操作摘取小鼠脾臟，置于預冷的含1%胎牛血清的R/MINI-1640培養液中，小心剪去脂肪和結締組織；用無菌注射器芯將脾臟擠壓通過200 目篩，獲得單個細胞。沿離心管壁緩慢加入4 倍體積的紅細胞裂解液，在冰浴中裂解5～10 min，1 500 r/min離心10 min；Hank’s液漂洗后，加入5 倍體積含有10%胎牛血清的R/MINI-1640培養液重懸細胞，經臺盼藍（0.4%）染色確保細胞活度大于95%后，用完全培養基調整細胞密度為1×107個/mL。每孔100 μL，加入96 孔細胞培養板中，每孔細胞為1×106個。設空白對照（生理鹽水）組、PCSPP低、中、高劑量（150、300、600 μg/mL）組、Con A（5 μg/mL）和LPS（10 μg/mL）陽性對照組，每組3 個復孔。繼續培養48 h，在492 nm波長處采用噻唑藍法測吸光度，根據公式（1）計算淋巴細胞增殖刺激率。

1.3.2 小鼠脾巨噬細胞活性測定

取荷瘤小鼠，頸椎脫臼法處死后，無菌操作摘取小鼠脾臟，置于預冷的含1%胎牛血清的R/MINI-1640培養液中，小心剪去脂肪和結締組織；用無菌注射器芯將脾臟擠壓通過200 目篩，獲得單個細胞。1 500 r/min離心10 min，去上清液，用含10%小牛血清的R/MINI-1640培養液重懸細胞，制備約1×108～5×108個/mL的細胞懸液，采用貼壁法純化巨噬細胞。將純化后的脾巨噬細胞加入96 孔細胞培養板中，每孔100 μL（1×105個）。設空白對照（生理鹽水）組，PCSPP低、中、高劑量（150、300、600 μg/mL）組，每組3 個復孔。培養48 h后，每孔吸棄100 μL上清液，加入100 μL中性紅；繼續培養30 min，1 500 r/min離心10 min，棄掉上清液，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）反復沖洗3 次，加入200 μL裂解液室溫放置過夜，在589 nm波長處測吸光度，根據公式（2）計算吞噬率。

1.3.3 體內抗腫瘤實驗

取50 只C57BL/6J小鼠，每只注射0.2 mL（1×107個/mL）S180細胞懸液于右前肢腋窩下。注射24 h后將小鼠隨機分為5 組，每組10 只，即模型組，PCSPP低、中、高劑量（150、300、600 mg/kg）組，CTX（25 mg/kg）組。腹腔注射給藥，每日1 次，給藥21 d，注射體積均為0.2 mL，模型組給予等體積生理鹽水。末次給藥后24 h，摘眼球取血，制備血清并分裝凍存。小鼠采用頸椎脫臼法處死，取瘤塊、脾臟和胸腺稱質量并計算腫瘤抑制率、脾臟指數和胸腺指數，分別根據公式（3）～（5）計算。

1.3.4 流式細胞術檢測荷瘤小鼠脾細胞中T淋巴細胞亞群

按照1.3.1節方法制備荷瘤小鼠脾淋巴細胞懸液，取100 μL脾淋巴細胞懸液于1.5 mL離心管中，按照說明書中的操作步驟加入適量抗小鼠CD4＋和抗小鼠CD8＋抗體，充分振蕩混勻后，4 ℃靜置30 min，加入1 mL PBS，離心后棄上清液，再加入0.5 mL PBS，在流式細胞儀中進行檢測。

1.3.5 ELISA法檢測荷瘤小鼠血清中細胞因子含量

采用間接酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法，按照試劑盒操作手冊中的實驗步驟，檢測荷瘤小鼠血清中IL-2、TNF-α和IFN-γ的表達量。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 PCSPP對小鼠脾淋巴細胞增殖刺激率和巨噬細胞活性的影響

表1 PCSPP對小鼠脾淋巴細胞增殖刺激率的影響（n＝5）Table1 Effect of PCSPP on proliferation stimulation ratio of spleen lymphocytes (n= 5)

表2 PCSPP對小鼠巨噬細胞吞噬率的影響（n＝ 5）Table2 Effect of PCSPP on phagocytic activity of macrophages (n= 5)

由表1可知，與空白對照組相比，PCSPP各劑量組小鼠脾淋巴細胞增殖活性均呈顯著提高趨勢，差異具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），并呈劑量依賴效應；同時，PCSPP對小鼠脾巨噬細胞活性也均有一定的促進作用，與空白對照組比較差異具有統計學意義（P＜0.01）（表2）；以上結果表明，PCSPP具有促進免疫功能的作用。

2.2 PCSPP對S180荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

表3 PCSPP對S180荷瘤小鼠腫瘤生長的影響（n＝10）Table 3Antitumor effects of PCSPP in S180 tumor-bearing mice (n= 10)

由表3可知，CTX對S180荷瘤小鼠生長的抑制作用最為明顯，抑制率高達52.2%；低、中、高劑量組的PCSPP對S180的生長也具有明顯抑制作用，其抑制率分別為11.9%、20.9%和25.4%；以上結果表明，PCSPP對小鼠骨肉瘤細胞S180體內生長具有抑制作用，且該作用具有劑量依賴效應。

2.3 PCSPP對S180荷瘤小鼠脾臟指數和胸腺指數的影響

表4 PCSPP對S180荷瘤小鼠脾臟指數和胸腺指數的影響（n＝ 10）Table4 Effect of PCSPP on spleen index and thymus index in S180 tumor-bearing mice (n= 10)

由表4可知，CTX可以極顯著降低荷瘤小鼠脾臟指數和胸腺指數（P＜0.01），而低、中、高劑量組的PCSPP均可以明顯增加荷瘤小鼠的脾臟指數和胸腺指數（P＜0.05或P＜0.01），表明PCSPP對S180荷瘤小鼠的免疫器官具有一定的保護作用。

2.4 PCSPP對S180荷瘤小鼠T細胞亞群CD4＋和CD8＋的影響

圖1 流式細胞術檢測PCSPP對S180荷瘤小鼠T細胞亞群CD4和CD8的影響Fig. 1 Effect of PCSPP on CD4＋ and CD8＋ for T cells subset in S180 tumor-bearing mice by flow cytometry

由圖1、表5可知，給予低、中、高劑量的PCSPP后，各給藥組小鼠CD4＋、CD8＋ T細胞濃度較模型組均有極顯著提高，差異具有統計學意義（P＜0.01），但CD8＋T細胞濃度增加幅度要低于CD4＋ T細胞濃度；同時，PCSPP各劑量組的CD4＋/CD8＋比值與模型組比較，也呈現極顯著性增加（P＜0.01）；以上結果進一步表明，PCSPP的抗腫瘤作用與免疫調節作用有關。

表5 PCSPP對S180荷瘤小鼠T細胞亞群CD4和CD8的影響（n＝10）Table5 Effect of PCSPP on CD4 and CD8 for T cells subset in S180 tumor-bearing mice (n= 10)

表5 PCSPP對S180荷瘤小鼠T細胞亞群CD4和CD8的影響（n＝10）Table5 Effect of PCSPP on CD4 and CD8 for T cells subset in S180 tumor-bearing mice (n= 10)

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2.5 PCSPP對S180荷瘤小鼠血清細胞因子的影響

表6 PCSPP對S180荷瘤小鼠血清細胞因子的影響（n＝ 10）Table6 Effect of PCSPP on serum cytokine levels in S180 tumor-bearing mice (n= 10)pg/mL

由表6可知，與模型組相比，CTX組小鼠血清中細胞因子IL-2、TNF-α及IFN-γ的水平極顯著降低（P＜0.01）；而低、中、高劑量的PCSPP均可以極顯著提高荷瘤小鼠血清中細胞因子IL-2、TNF-α及IFN-γ的水平（P＜0.01），且具有劑量依賴性；以上結果表明，PCSPP的抗腫瘤作用可能與IL-2、TNF-α及IFN-γ等細胞因子的表達水平提高有關。

3 討 論

惡性腫瘤的死亡率和發病率逐年增加，對人類生命和健康造成嚴重威脅。目前為止，化療仍是多種惡性腫瘤的主要治療手段，但其選擇性差，且存在嚴重的毒副作用及耐藥性，臨床效果往往不能令人滿意[8-10]。近年來，從傳統中藥材中篩選具有腫瘤抑制作用的活性成分或先導化合物越來越受到抗腫瘤藥物研究人員的重視。迄今為止，來源于植物的抗腫瘤制劑如紫杉醇、喜樹堿、長春新堿等已成為多種腫瘤化療的首選，此類藥物已占抗腫瘤藥物市場的30%以上[11-13]。中藥應用歷史悠久、資源豐富，從中藥中篩選抗腫瘤先導化合物或有效成分，并開展相關機制研究，將具有非常重要的意義。本研究以PCSPP為研究對象，發現其具有較好的抑制S180荷瘤小鼠腫瘤生長的作用，其在低、中、高劑量下的腫瘤抑制率分別為11.9%、20.9%和25.4%，具有較好的應用前景。

機體免疫防御功能的強弱與抗腫瘤作用密切相關，脾臟指數和胸腺指數常作為觀察藥物對免疫功能影響的重要指標[14-15]。本研究發現低、中、高劑量組的PCSPP均可以使荷瘤小鼠的脾臟指數和胸腺指數明顯增加，表明其具有保護S180荷瘤小鼠免疫功能的作用；此外，本研究也發現PCSPP具有促進正常小鼠脾淋巴細胞增殖和巨噬細胞吞噬活性的作用。機體抗腫瘤免疫的主要機制以T細胞介導的細胞免疫為主，成熟的T細胞可以分為CD4＋和CD8＋兩個細胞亞群，而T細胞亞群的數目和比值是評價免疫功能狀態最有價值的指標[16-17]。CD4＋T細胞可產生大量細胞因子如IL-2、TNF-α、IFN-γ等，也可以直接殺傷腫瘤細胞[18-19]；CD8＋ T細胞在細胞因子以及CD4＋ T細胞的協同作用下發揮殺傷腫瘤細胞作用[20-21]。本研究結果證實，給予荷瘤小鼠PCSPP后，CD4＋、CD8＋ T細胞濃度及CD4＋/CD8＋比值與模型組比較，均顯著增加。以上結果進一步表明，PCSPP的抗腫瘤作用與免疫調節作用有關。

在腫瘤出現時，機體通過促使IL-2、TNF-α及IFN-γ等細胞因子分泌增加，進而發揮抗腫瘤作用[22-23]。IL-2具有輔助抗體生成、促進淋巴細胞有絲分裂和增強對殺傷細胞的殺傷功能等生物學作用，是細胞因子網絡的重要成員[24-25]。TNF-α除了能夠和IL-2等細胞因子相互協調發揮一系列的免疫功能外，還具有誘導細胞凋亡、壞死及激活淋巴細胞因子等多種抗腫瘤活性[26-28]。IFN-γ具有上調MHC分子的表達和激活巨噬細胞等功能，是調節免疫系統的主要細胞因子[29-30]。本研究結果發現，CTX組S180荷瘤血清中IL-2、TNF-α及IFN-γ的水平顯著降低，細胞毒性較強，可以損害機體的免疫功能；而PCSPP能促進IL-2、TNF-α及IFN-γ等細胞因子水平的表達。此結果進一步提示，PCSPP的抗腫瘤作用與提高S180荷瘤小鼠血清中IL-2、TNF-α及IFN-γ等細胞因子水平，增強機體免疫能力有關。綜上所述，PCSPP具有明顯的腫瘤抑制作用，其對腫瘤細胞生長的抑制作用與提高免疫能力有關。