軟棗獼猴桃黃酮對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

石 浩，王仁才，吳小燕，劉 瓊

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta Sieb.et Zucc.）為獼猴桃科獼猴桃屬多年生落葉藤本植物，是9 種光果獼猴桃之一[1]。在我國(guó)主要分布于東北地區(qū)、華北地區(qū)、長(zhǎng)江流域及山東省，在朝鮮、日本、俄羅斯亦有分布[2]。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，軟棗獼猴桃中含有大量的功效成分物質(zhì)，如黃酮類[3]、生物堿類[4]、多酚類、花色苷類[5]、多糖類[6]、萜類[7-8]、脂肪酸類[9]等。其中黃酮類物質(zhì)主要有檞皮素-3-O-蕓香糖苷、異檞皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、5,7,3’,4’-四羥基黃酮醇等[10]。黃酮類物質(zhì)是一種天然抗氧化劑，對(duì)自由基具有一定的清除作用，能起到抗氧化[11-12]、防止動(dòng)脈粥樣硬化[13]、延緩衰老[14-15]等作用。自由基屬于體內(nèi)的一種高能分子，能夠破壞細(xì)胞膜，降低細(xì)胞活性，加速細(xì)胞內(nèi)沉積物的生成，引發(fā)各種并發(fā)癥[16-17]。同時(shí)，當(dāng)前生態(tài)環(huán)境污染的日益嚴(yán)重以及精神、物質(zhì)生活壓力的增加直接或間接地導(dǎo)致了人體內(nèi)自由基含量的增加[18-19]；因此，對(duì)控制機(jī)體內(nèi)自由基數(shù)量的研究是非常必要的。人永生化表皮細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞）保留了表皮全層的分化能力，與正常人角質(zhì)細(xì)胞非常接近，且其培養(yǎng)方法與原代細(xì)胞培養(yǎng)相比相對(duì)簡(jiǎn)單，可以不限次數(shù)的傳代[20-21]，故選取HaCaT細(xì)胞建立過(guò)氧化氫（H2O2）氧化損傷模型，并用此模型進(jìn)行抗氧化物質(zhì)的相關(guān)評(píng)價(jià)與研究。本研究以湖南省瀏陽(yáng)市大圍山軟棗獼猴桃為原料，運(yùn)用噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）法，以細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）水平為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察軟棗獼猴桃黃酮類物質(zhì)對(duì)HaCaT細(xì)胞的抗氧化作用，為軟棗獼猴桃天然抗氧化功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

軟棗獼猴桃為湖南瀏陽(yáng)市大圍山野生嫁接馴化品種。

蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氯仿、正丁醇、VC國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；HaCaT細(xì)胞 長(zhǎng)沙湘雅醫(yī)院；1640高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、Gibco胰酶消化液 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；MTT 美國(guó)Sigma公司；二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒康為世紀(jì)生物科技有限公司；SOD檢測(cè)試劑盒 南京建成生物科技有限公司；ROS檢測(cè)試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)、多功能酶標(biāo)分析儀 深圳市匯松科技發(fā)展有限公司；自動(dòng)平衡離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱 上海三騰儀器有限公司；倒置生物顯微鏡 北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司；FACSCalibur流式細(xì)胞分析儀 美國(guó)BD公司；冷凍干燥儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；低速離心機(jī)、搖床、精密電子天平 常熟市雙杰測(cè)試儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 供試樣的制備

軟棗獼猴桃果實(shí)干燥粉末經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液超聲提取，提取液經(jīng)濃縮后加入1/3體積的Sevag試劑（氯仿∶正丁醇＝4∶1，V∶V）混合振蕩20 min后靜置15 min，除去水層與溶劑交界處的變性蛋白質(zhì)；濾液經(jīng)X-5大孔吸附樹(shù)脂和聚酰胺層析柱相繼洗脫，得到初步純化的黃酮溶液，將其冷凍干燥成粉末，其純度為80.43%。

1.3.2 VC、黃酮質(zhì)量濃度的篩選

參考文獻(xiàn)[13,22]進(jìn)行VC、黃酮質(zhì)量濃度的篩選。使用無(wú)菌的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶解VC和黃酮粉末，室溫下避光存放24 h，混勻后使用0.22 μm針頭濾器過(guò)濾除菌，貯存于4 ℃待用。有效期4 周。其中黃酮設(shè)0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 7 個(gè)質(zhì)量濃度組，VC設(shè)0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 mg/mL 8 個(gè)質(zhì)量濃度組，每個(gè)質(zhì)量濃度組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。

1.3.3 H2O2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞氧化損傷模型的建立

參考文獻(xiàn)[23]建立H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化損傷模型。將H2O2稀釋成2、5、10、15、20、30、40、50、60 μmol/L 9 個(gè)濃度組，每個(gè)濃度組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。

1.3.4 黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷的預(yù)保護(hù)作用

在1.3.2節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，篩選出5 個(gè)質(zhì)量濃度的黃酮類物質(zhì)對(duì)HaCaT細(xì)胞進(jìn)行預(yù)保護(hù)，再加入最佳濃度H2O2誘導(dǎo)損傷，考察黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞氧化損傷的預(yù)保護(hù)作用。

1.3.5 MTT實(shí)驗(yàn)

從－18 ℃冰箱中取出已配制好的MTT溶液，置于37 ℃水浴。自培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板，向每孔加入20 μL MTT溶液，避光，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。每孔加入150 μL的DMSO，置于振蕩器上振蕩5 min后，于酶標(biāo)儀上讀數(shù)，波長(zhǎng)為490 nm。按式（1）計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率。

1.3.6 DCFH-DA熒光探針染色實(shí)驗(yàn)

采 用2’,7’-二 氯 熒 光 黃 雙 乙 酸 鹽 （ 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）標(biāo)記法[24]。按照體積比1∶1 000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其工作液終濃度為10 μmol/L。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，消化離心（1 000 r/min、5～10 min），收集細(xì)胞，加1 mL DCFH-DA工作液，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20?min。孵育后用PBS洗兩次，充分去除細(xì)胞外DCFH-DA以降低背景熒光的干擾，于1 000 r/min離心5 min，收集沉淀，用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.3.7 SOD活力測(cè)定

1.3.7.1 BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度

用與待測(cè)蛋白樣品一致的稀釋液稀釋牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）得到標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算BCA工作液總量，根據(jù)計(jì)算出的BCA工作液需要量，將BCA-A和BCA-B兩種試劑按照50∶1的體積比配制BCA工作液。將稀釋好的BSA標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)蛋白樣品各25 μL分別加到做好標(biāo)記的96 孔板微孔中，每孔加入200 μL BCA工作液，充分混勻，蓋上96 孔板蓋，37 ℃孵育30 min，冷卻至室溫，用酶標(biāo)儀在562 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每個(gè)樣品及BSA標(biāo)準(zhǔn)品的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.7.2 SOD活力的測(cè)定

將細(xì)胞懸液置于－80 ℃冷凍30 min后，37 ℃水浴5 min，按此操作反復(fù)凍融細(xì)胞4 次，以充分破壞細(xì)胞并使其釋放出細(xì)胞SOD活性成分，2 500 r/min離心20 min，小心收集上清液。取樣品溶液加入96 孔板中，設(shè)對(duì)照孔、對(duì)照空白孔、測(cè)定孔、測(cè)定空白孔4 種。按照SOD試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm處讀取OD值，并計(jì)算SOD抑制率和活力（式（2）、（3））。

1.3.8 ROS水平的測(cè)定

按照體積比1∶1 000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積（以能充分蓋住細(xì)胞為宜）稀釋好的DCFH-DA。37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，用胰酶消化并收集于流式細(xì)胞儀觀察檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Origin軟件制圖，運(yùn)用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。滿足正態(tài)性分布且方差齊的兩組之間差異的比較用兩組獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，多組之間差異的比較用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮及VC質(zhì)量濃度篩選結(jié)果

2.1.1 黃酮質(zhì)量濃度的篩選結(jié)果

圖1 不同質(zhì)量濃度黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞活性的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of A. arguta flavonoids on the viability of HaCaT cells

不同質(zhì)量濃度的黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞活性的影響存在一定的差異。由圖1可知，在0.1～1.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與空白組（0.0 mg/mL）相比，0.1、0.3、0.4、0.6、0.8 mg/mL的黃酮對(duì)細(xì)胞活性影響較小，細(xì)胞相對(duì)存活率均保持在100%左右，所以選擇這5 個(gè)黃酮質(zhì)量濃度進(jìn)一步研究其對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷的預(yù)保護(hù)作用。

2.1.2 VC質(zhì)量濃度的篩選結(jié)果

不同質(zhì)量濃度的VC對(duì)HaCaT細(xì)胞生物活性的影響具有一定差異性。由圖2可知，在0.01～0.08 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與空白組（0.00 mg/mL）相比，0.07 mg/mL VC相對(duì)于其他質(zhì)量濃度而言對(duì)細(xì)胞活性影響最小，細(xì)胞相對(duì)存活率更接近100%，所以選擇此VC質(zhì)量濃度進(jìn)一步研究其對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷的預(yù)保護(hù)作用。

圖2 VC對(duì)HaCaT細(xì)胞活性的影響Fig. 2 Effect of VC on the viability of HaCaT cells

2.2 H2O2氧化損傷模型的建立結(jié)果

圖3 H2O2對(duì)HaCaT細(xì)胞活性的影響Fig. 3 Effect of H2O2 on the viability of HaCaT cells

不同濃度的H2O2對(duì)HaCaT細(xì)胞生物活性的影響有所不同。由圖3可知，在2～15 μmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著H2O2濃度的增加，細(xì)胞活性總體呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，但不明顯。當(dāng)H2O2濃度達(dá)到20 μmol/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞造成了一定的損傷，此時(shí)細(xì)胞相對(duì)存活率為80%左右。當(dāng)H2O2濃度為30 μmol/L時(shí)，細(xì)胞的損傷率已十分明顯，此時(shí)細(xì)胞相對(duì)存活率小于40%，故選用此濃度誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的氧化損傷模型，以進(jìn)行進(jìn)一步的預(yù)保護(hù)研究。

2.3 黃酮及VC對(duì)H2O2氧化損傷模型的預(yù)保護(hù)作用

圖4 不同質(zhì)量濃度黃酮對(duì)H2O2氧化損傷模型的預(yù)保護(hù)作用Fig. 4 Protective effect of different concentrations of A. arguta flavonoids on H2O2-induced oxidative damage model

在30 μmol/L H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷模型中，不同質(zhì)量濃度黃酮及VC對(duì)HaCaT細(xì)胞的預(yù)保護(hù)作用存在差異。由圖4可知，當(dāng)黃酮質(zhì)量濃度分別為0.3、0.6 mg/mL時(shí)，對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化損傷的預(yù)保護(hù)作用最強(qiáng)，其細(xì)胞相對(duì)存活率均為60%左右。0.07 mg/mL VC產(chǎn)生的預(yù)保護(hù)效果稍強(qiáng)于黃酮，細(xì)胞相對(duì)存活率達(dá)69%左右。選擇黃酮物質(zhì)量濃度0.3、0.6 mg/mL分別作為黃酮低、高質(zhì)量濃度組，與0.07 mg/mL VC組進(jìn)行后續(xù)的相關(guān)研究。

2.4 黃酮及VC對(duì)細(xì)胞內(nèi)SOD活力的影響

不同處理組間SOD活力表現(xiàn)出較大的差異。如表1所示，當(dāng)采用30 μmol/L H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷后，SOD活力非常低，大約只有空白對(duì)照組SOD活力（10.14 U/mg）的1/3。當(dāng)加入VC及黃酮對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)保護(hù)后，細(xì)胞內(nèi)的SOD活力有所增加，兩者相對(duì)于模型組均表現(xiàn)出顯著性差異，其中VC組增加了139.30%，黃酮低質(zhì)量濃度組增加了85.63%，這表明黃酮及VC對(duì)H2O2造成的HaCaT氧化損傷有較好的預(yù)保護(hù)作用，VC抗氧化活性稍強(qiáng)于黃酮。黃酮高質(zhì)量濃度組與黃酮低質(zhì)量濃度組對(duì)HaCaT細(xì)胞的保護(hù)作用不具有顯著性差異，也間接說(shuō)明較低質(zhì)量濃度黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞同樣具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

表1 H2O2損傷及抗氧化物質(zhì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)SOD活力、ROS水平的影響Table1 Effect of H2O2 damage and antioxidant on intracellular SOD and ROS levels

2.5 黃酮及VC對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

圖5 細(xì)胞ROS測(cè)定流式圖Fig. 5 Flow cytometric analysis of ROS in cells

不同處理組間ROS水平同樣表現(xiàn)出較大的差異。由表1、圖5可以看出，用30 μmol/L H2O2誘導(dǎo)氧化損傷模型后，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平明顯增高，相對(duì)于空白對(duì)照組（393.56），模型組的ROS水平（677.80）增加了近1 倍；當(dāng)加入抗氧化物質(zhì)黃酮、VC進(jìn)行預(yù)保護(hù)后，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平較模型組均有一定程度的降低，黃酮高質(zhì)量濃度組降低了12.65%、VC組降低了17.65%，表明黃酮及VC對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化損傷有一定的預(yù)保護(hù)作用。但相對(duì)于空白對(duì)照組，黃酮及VC組ROS水平均具有一定程度的升高，從而說(shuō)明兩者對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化損傷的預(yù)保護(hù)作用并不完全。黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞的預(yù)保護(hù)作用稍低于VC，黃酮高質(zhì)量濃度組與黃酮低質(zhì)量濃度組對(duì)HaCaT細(xì)胞的預(yù)保護(hù)作用效果相差不大。

3 討 論

本研究以HaCaT細(xì)胞為研究對(duì)象，以VC作為對(duì)照，全面分析了軟棗獼猴桃中黃酮類化合物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞損傷的預(yù)保護(hù)作用。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在樣品實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度（0.1～1.0 mg/mL）范圍內(nèi)，0.3、0.6 mg/mL的黃酮及0.07 mg/mL的VC對(duì)HaCaT細(xì)胞影響較小，且這兩個(gè)質(zhì)量濃度的黃酮對(duì)細(xì)胞抗氧化活性的保護(hù)效果最好，相對(duì)于模型組（H2O2處理組），細(xì)胞相對(duì)存活率均提高了20%左右，略低于VC組。黃酮高、低質(zhì)量濃度組對(duì)細(xì)胞抗氧化能力的影響差異小于3%，說(shuō)明較低質(zhì)量濃度黃酮（0.3 mg/mL）對(duì)細(xì)胞依然具有較強(qiáng)的抗氧化作用。在ROS水平檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，高質(zhì)量濃度組黃酮及VC可有效地降低細(xì)胞中ROS水平，相對(duì)于模型組，其ROS水平分別降低了12.65%、17.65%；在SOD活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，黃酮低質(zhì)量濃度組及VC可有效地增加細(xì)胞中SOD的活力，相對(duì)于模型組，SOD的活力分別增加了85.63%、139.30%。這表明黃酮及VC對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷有一定的預(yù)保護(hù)作用。這與高揚(yáng)[12]、步犁[25]等研究的利用HaCaT細(xì)胞和原代人皮膚成纖維細(xì)胞篩選抗氧化物質(zhì)的結(jié)果大致相似。

本研究結(jié)果表明，黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞具有一定的抗氧化預(yù)保護(hù)作用，軟棗獼猴桃中黃酮類物質(zhì)具有較好的抗氧化活性。抗氧化活性的評(píng)價(jià)方法包括傳統(tǒng)的化學(xué)方法、細(xì)胞方法、動(dòng)物模型法和人體志愿者法[26]。目前以細(xì)胞為基礎(chǔ)的篩選模型在天然產(chǎn)物抗氧化活性評(píng)價(jià)研究中逐步得到應(yīng)用，其中人體皮膚細(xì)胞常被選用為測(cè)試對(duì)象，以經(jīng)氧化損傷誘導(dǎo)后抗氧化物質(zhì)清除體內(nèi)自由基的能力來(lái)評(píng)價(jià)其抗氧化活性的強(qiáng)弱[27-28]。細(xì)胞法可以對(duì)氧化應(yīng)激所造成的損傷進(jìn)行分子水平的分析，對(duì)于抗氧化物質(zhì)的評(píng)價(jià)也更接近人體環(huán)境[29-30]。軟棗獼猴桃中黃酮提取物是一種較強(qiáng)的氧化損傷保護(hù)劑，本研究為今后相關(guān)天然抗氧化性保健食品的開(kāi)發(fā)和利用提供了一定的理論依據(jù)。但本研究結(jié)果仍處于細(xì)胞水平，尚且不能全面反映藥物在人體內(nèi)的吸收代謝過(guò)程，后續(xù)可通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及相關(guān)的藥理學(xué)、藥效實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步推斷其具體的抗氧化活性損傷體內(nèi)保護(hù)機(jī)制。