鯽魚皮膠原肽對小鼠的促鈣吸收作用

劉艷雙，侯 燾，郭丹郡，劉維維，石 文，何 慧,

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.環(huán)境食品學(xué)教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

膠原肽（collagen peptides，CPs）是膠原蛋白或明膠經(jīng)酶解后的分子質(zhì)量幾百至幾千Da不等的產(chǎn)物，具有美容[1-2]、降血壓[3-5]、抗癌[5]、抗氧化[6-9]、促進骨代謝[10-12]、傷口愈合[13]、抑菌[14]等多種生理功能。貢雯玉等[15]采用高效液相色譜法檢測鯽魚（Carassius auratus）不同組織中膠原蛋白含量，結(jié)果顯示魚皮、魚肉組織中膠原蛋白含量分別為106.62、24.75 mg/g，可見以鯽魚皮為原料提取膠原蛋白，制備生物活性膠原肽，既可以實現(xiàn)下腳料的再利用，又可以滿足人們對膠原蛋白安全性和產(chǎn)量的需求。

我國營養(yǎng)調(diào)查結(jié)果表明，國民鈣攝入量普遍偏低，每天約為400～500 mg，僅達(dá)到推薦量的50%左右。僅僅通過提高飲食中鈣的絕對含量，仍不能有效改善缺鈣現(xiàn)象。在補鈣的同時增加飲食中促鈣吸收因子的攝入，提高機體對鈣的有效吸收，將是有效之策。VD[16]、酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPPs）[17-18]、卵黃高磷蛋白肽（phosvitin peptides，PPPs）[19]、菊粉[20]等都是已知的具有良好促鈣吸收作用的生物活性物質(zhì)。近年來，越來越多的研究傾向于從食品加工下腳料中提取蛋白用于生物活性肽的制備，如魚骨[21]和魚鱗[22]、咸鴨蛋清[23-24]等。成靜等[25]以膠原肽螯合鈣（200～400 Da小肽）為受試物，通過測定動物實驗中血清鈣、股骨鈣含量及股骨指數(shù)，評價膠原肽鈣螯合物對缺鈣模型小鼠具有補鈣功能。分子質(zhì)量在20 000 Da以下，特別是4 000～6 000 Da的水解明膠能有效改善和抑制骨強度的下降，維持骨的機能，預(yù)防骨折，是預(yù)防、治療骨質(zhì)疏松癥的有效成分[26]。鯽魚是我國國民消費的大眾品種，在淡水魚中營養(yǎng)最為豐富，本實驗以昆明小鼠為實驗動物建立低鈣膳食模型，通過考察血清、骨生物學(xué)及骨微觀結(jié)構(gòu)，對鯽魚皮膠原肽促進鈣吸收及增加骨密度進行研究，以期為鯽魚皮下腳料的高值化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

昆明雄性小鼠，3～4 周齡，體質(zhì)量20～22 g，湖北省動物研究中心提供，實驗動物許可證：SCXK（鄂）：2015-0018。

CPPs（蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%） 南京通升食品配料有限公司；血清鈣試劑盒、血清磷試劑盒、血清堿性磷酸酶試劑盒 南京建成生物生物有限公司；碳酸鈣（鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)36.8%）、鹽酸、硝酸、高氯酸（均為分析純）國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204型電子天平 梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；LGJ-12冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；PB-10標(biāo)準(zhǔn)型pH計德國賽多利斯股份公司；Laborota4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器德國Heidolph公司；板式膜（截留分子質(zhì)量小于5 kDa）美國Millipore公司；AA-6300C原子吸收分光光度儀日本島津公司；Exploit數(shù)顯游標(biāo)卡尺 開拓工具有限公司；TA.XT.PLUS物性測試儀 英國Stable Micro Systems公司；XR-46雙能X射線骨密度儀 美國Norland公司；JEOL JSM-6390/LV掃描電子顯微鏡 日本NTC公司；Microfuge 20R高速冷凍離心機 貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司；DM3000熒光顯微鏡 徠卡儀器（德國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鯽魚皮CPs的制備

將膠原蛋白用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為3 g/100 mL的溶液，沸水浴中加熱，并攪拌20 min，冷卻后放入恒溫水浴攪拌器中，設(shè)置溫度為50 ℃，調(diào)至pH 7.0后，加入復(fù)合蛋白酶（加酶量3×103U/g），滴加1 mol/L NaOH溶液使酶解pH值維持在7.0左右，并記錄加堿量，酶解3 h后，沸水浴加熱10 min，使酶鈍化，冷卻至室溫后，4 000 r/min離心10 min，取上清液。將上述酶解液通過截留分子質(zhì)量小于5 kDa的超濾膜，將超濾膜透過物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥，得到分子質(zhì)量小于5 kDa的膠原肽CPs（用凱氏定氮法測得其質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于90%）。

1.3.2 動物低鈣飼料配方

參照美國營養(yǎng)學(xué)會AIN-93嚙齒類動物純化飼料配方標(biāo)準(zhǔn)并略作修改，制作小鼠低鈣飼料。低鈣飼料由南通特洛菲飼料科技有限公司（實驗動物飼料高科技平臺）制作，配方為（以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計）：酪蛋白21.85%、玉米淀粉48.10%、蔗糖10.00%、玉米油5.00%、纖維素5.00%、半胱氨酸0.30%、氯化膽堿0.25%、礦物鹽混合物0.35%（含0.1%鈣）、維生素混合物1.00%。

1.3.3 動物分組及給藥

4 周齡昆明雄性小鼠60 只，按體質(zhì)量隨機分成6 組，分別為正常組、低鈣模型組、碳酸鈣組、CPs低劑量組（CPs低＋CaCO3）、CPs高劑量組（CPs高＋CaCO3）、CPPs對照組（CPPs＋CaCO3），適應(yīng)喂養(yǎng)1 周后，期間自由進食和飲水。實驗采取灌胃方式給予各組相應(yīng)藥品。正常組喂食正常飼料（鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%），其余各組喂食低鈣飼料（鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%），各組碳酸鈣劑量參照人體每日推薦攝入量800 mg/60 kg mb（13.33 mg/kg mb）的10 倍，設(shè)置為133.3 mg/kg mb，選擇CPPs、CPs低、高劑量分別為500、500、1 000 mg/kg mb。

1.3.4 檢測指標(biāo)及方法

實驗期間，兩天記錄一次小鼠體質(zhì)量，6 周實驗期滿后，禁食12 h，眼球取血，4 ℃條件下3 500 r/min離心分離血清，待測血清指標(biāo)，脫頸椎處死。實驗至第5 周末，將小鼠移入代謝籠進行鈣代謝實驗。期間定時灌胃，準(zhǔn)確記錄飼料攝入量，收集糞便凍干稱質(zhì)量。糞鈣量采用原子吸收分光光譜法測定。鈣的攝入量、表觀吸收率分別按照公式（1）、（2）計算。

血清生化指標(biāo)測定：血清鈣、血清磷和堿性磷酸酶含量均按照試劑盒說明書要求的條件和程序進行測定。

股骨、脛骨指標(biāo)測定：取出兩側(cè)股骨、脛骨，去除肌肉及軟組織后，測量長度及骨鈣含量，用浸泡過生理鹽水的紗布包裹骨頭，－20 ℃保存?zhèn)溆谩９堑V物密度（bone mineral density，BMD）及骨礦物含量（bone mineral content，BMC）采用XR46雙能X射線骨密度儀測定。

骨微觀結(jié)構(gòu)觀察：取各組小鼠處理后的脛骨烘干至恒質(zhì)量，掃描電子顯微鏡下觀察脛骨表面結(jié)構(gòu)。

骨小梁形態(tài)學(xué)觀察：剝離小鼠右側(cè)股骨，將附著的肌肉和筋膜剔除干凈，然后浸入4%的多聚甲醛中固定，固定后逐級脫水，硝酸法脫鈣，石蠟切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，100 倍光學(xué)顯微鏡觀察脛骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 CPs對小鼠血清生化指標(biāo)的影響

表1 CPs對小鼠血清生化指標(biāo)的影響（n＝6）Table1 Effects of CPs on serum biochemical parameters of mice (n= 6)

由表1可知，與模型組相比，正常組、碳酸鈣組、CPs低劑量組、CPs高劑量組和CPPs對照組血清鈣、血清磷含量均無顯著差異（P＞0.05）；但CPs低劑量組、CPs高劑量組、CPPs組和碳酸鈣組血清堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活力卻顯著降低（P＜0.05）；且CPs低劑量組血清ALP活力顯著低于碳酸鈣組（P＜0.05）。

2.2 CPs對小鼠鈣代謝的影響

圖1 各組小鼠鈣表觀吸收率Fig. 1 Apparent calcium absorption rate of mice

從圖1可知，由于低鈣模型組處于鈣缺乏狀態(tài)，其鈣表觀吸收率顯著高于正常組、碳酸鈣組、CPs低劑量組、CPs高劑量組、CPPs對照組（P＜0.05）；CPs低劑量組、CPs高劑量組、CPPs對照組的鈣表觀吸收率顯著高于正常組、碳酸鈣組（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，補充碳酸鈣、CPs、CPPs可增加鈣在小鼠體內(nèi)的表觀吸收率，補充CPs效果與公認(rèn)補鈣肽CPPs相比無顯著性差異（P＞0.05）；CPs低劑量組、CPs高劑量組其鈣表觀吸收率顯著高于碳酸鈣組（P＜0.05）。

2.3 CPs對小鼠股骨、脛骨干質(zhì)量指數(shù)和長度的影響

表2 CPs對小鼠股骨、脛骨干質(zhì)量指數(shù)和長度的影響（n＝6）Table2 Effect of CPs on length and dry mass index of femurs and tibiae in mice (n= 6)

由表2可知，與正常組相比，模型組的股骨、脛骨長度和干質(zhì)量指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；CPs低劑量組各指標(biāo)無顯著性差異（P＞0.05）。CPs低劑量組其脛骨干質(zhì)量指數(shù)顯著高于CPs高劑量組（P＜0.05）；其股骨、脛骨干質(zhì)量指數(shù)、脛骨長度與CPPs對照組相比，均無顯著性差異（P＞0.05），但股骨長度卻顯著高于CPPs對照組（P＜0.05），提示低劑量CPs組比同劑量的CPPs補鈣效果略好。

2.4 CPs對小鼠股骨脛骨骨鈣含量、遠(yuǎn)心端BMD、BMC的影響

表 3 CPs對小鼠股骨、脛骨骨鈣含量、BMD、BMC的影響（n＝ 6）Table3 Effect of CPs on calcium content, BMD and BMC of femurs and tibiae in mice (n= 6)

由表3可知，與模型組相比，正常組、CPs低劑量組、CPPs對照組其股骨鈣含量、遠(yuǎn)心端BMD、BMC顯著提高（P＜0.05）；與碳酸鈣組相比，CPs低劑量組股骨骨鈣含量顯著提高（P＜0.05）。與模型組相比，正常組、CPs低劑量組、CPs高劑量組、CPPs對照組脛骨鈣含量、遠(yuǎn)心端BMD、BMC顯著提高（P＜0.05）。與CPs高劑量組相比，CPs低劑量組脛骨遠(yuǎn)心端BMD顯著增加（P＜0.05）；與CPPs對照組相比，CPs低、高劑量組遠(yuǎn)心端BMC無顯著性差異（P＞0.05）。

2.5 CPs對小鼠脛骨表面微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖2 各組小鼠脛骨掃描電子顯微鏡圖（×500）Fig. 2 Scanning electron microscope of tibiae in mice (× 500)

從圖2可以看出，正常組在電子顯微鏡下表面幾乎無明顯孔隙，呈較淺溝壑狀。與正常組相比，模型組骨骼表面疏松多孔、孔徑較大，碳酸鈣組、CPs低劑量組、CPs高劑量組、CPPs對照組疏松情況明顯改善，孔徑變小、排列緊密，其中CPs高劑量組表面平整，CPs低劑量組表面與正常組較為相似。

2.6 CPs對小鼠股骨骨小梁結(jié)構(gòu)的影響

圖3 各組小鼠股骨HE染色（×100）Fig. 3 Hematoxylin-eosin staining of femurs in mice (× 100)

從圖3可以看出，正常組單位面積骨小梁數(shù)目多且緊密排列，無明顯溶解斷裂現(xiàn)象；模型組單位面積骨小梁數(shù)目明顯減少，斷裂溶解嚴(yán)重；與模型組相比，碳酸鈣組、CPs低劑量組、CPs高劑量組、CPPs對照組骨小梁數(shù)目增加，有序緊密連接，無明顯斷裂現(xiàn)象。以上結(jié)果表明，CPs可以增加骨小梁數(shù)目及強度，從而促進骨骼生長。

3 討 論

本實驗以昆明雄性小鼠為研究對象，在成功建立小鼠缺鈣模型的基礎(chǔ)上，研究CPs對小鼠鈣吸收的促進作用。

喂食低鈣飼料小鼠的血清ALP活力、骨長度、骨干質(zhì)量指數(shù)、骨鈣含量、遠(yuǎn)心端BMD、BMC含量均顯著低于正常組，表明小鼠缺鈣模型構(gòu)建成功。鈣的吸收主要發(fā)生在小腸，小腸吸收的鈣占鈣吸收總量的90%[27]，通過飲食攝取的鈣不同時，機體對鈣的吸收率也會不同；當(dāng)機體處于鈣缺乏狀態(tài)下，鈣的吸收率會顯著提高。本研究中小鼠鈣代謝實驗表明，低鈣組小鼠處于嚴(yán)重鈣缺乏狀態(tài)，故其鈣吸收率顯著高于其他各組。CPs低、高劑量組鈣吸收率顯著高于正常組和碳酸鈣組，表明灌胃無機鈣與食物攝取鈣的鈣吸收效果相當(dāng)，而同時灌胃CPs時，其鈣吸收率顯著高于僅灌胃無機鈣的碳酸鈣組，表明CPs可以促進鈣在腸道中的吸收，從而達(dá)到促鈣吸收的效果。股骨指數(shù)可以反映骨骼生長。模型組小鼠處于鈣缺乏狀態(tài)，骨長度、骨干質(zhì)量指數(shù)顯著低于正常組、碳酸鈣組、CPs低、高劑量組和CPPs組；血清鈣與骨鈣水平維持動態(tài)平衡，當(dāng)血鈣出現(xiàn)降低趨勢，甲狀旁腺激素會促進骨鈣釋放入血，以維持血鈣穩(wěn)定，因此內(nèi)環(huán)境血鈣較為穩(wěn)定。血清磷參與內(nèi)環(huán)境的緩沖體系，故本實驗中各組之間血清鈣、磷無顯著差異。與此同時骨中成骨細(xì)胞活躍，合成血清ALP，使之釋放進入血液，此時會發(fā)生高骨轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，表現(xiàn)為血清ALP活力的升高、骨鈣、遠(yuǎn)心端BMD、BMC的降低。掃描電子顯微鏡、HE染色結(jié)果可以看出模型組小鼠骨表面疏松多孔，骨小梁變細(xì)且出現(xiàn)明顯斷裂現(xiàn)象，正常組與CPs組、CPPs組情況有明顯改善。從CPs低、高劑量組各指標(biāo)比較可以看出，低劑量組促鈣吸收效果優(yōu)于高劑量組，但組間無顯著性差異，這可能是由于CPs通過與鈣形成螯合物防止鈣在小腸中的沉積從而達(dá)到促鈣吸收效果，而當(dāng)CPs濃度過高時，由于鈣離子已全部參與反應(yīng)，肽的螯合率可能會有所下降所致。

由以上分析可得出如下結(jié)論：CPs通過提高鈣在小腸的吸收率，增加骨鈣含量、遠(yuǎn)心端BMD、BMC，從而達(dá)到促鈣吸收作用；同時增加骨小梁強度，促進鈣在骨骼上的沉積，改善低鈣膳食引起的骨質(zhì)疏松。