不同二氧化碳比例氣調對冷鮮雞肉中熒光假單胞菌的抑制作用

張新笑，章 彬,，卞 歡，王道營，吳滿剛，孫芝蘭,，諸永志,，徐為民,3

（1.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127；3.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京 210095）

冷鮮雞指檢疫后的活雞屠宰后迅速冷卻，使雞胴體中心溫度保持在0～4 ℃，然后進行分割、修整、包裝，并在后續的貯存、運輸和銷售過程中始終保持在0～4 ℃范圍內的新鮮雞[1]。相比熱鮮雞而言，冷鮮雞由于溫度迅速降低而使肌肉僵直程度減弱，再經過充分的解僵成熟過程，肉質變得柔軟、有彈性，并且具有滋味鮮美、安全衛生、營養價值高等優點[2]。近年來動物性H7N9流感的爆發，導致我國雞肉消費結構發生變化，由傳統的活雞交易方式轉變為定點屠宰，冷鮮上市。加之消費者消費觀念的轉變、政府相關規定的完善、食品企業的轉型升級，冷鮮雞的市場需求不斷增加。然而，目前市售的冷鮮雞主要采用保鮮膜/托盤等相對簡單的包裝方式，方法單一且保鮮效果不佳，落后的宰后保鮮技術嚴重制約著冷鮮雞的加工和發展[3]；因此通過冷鮮雞的保鮮技術以延長冷鮮雞的貨架期已成為冷鮮雞市場亟需解決的關鍵問題，具有重要的社會價值和實際指導意義。

氣調包裝技術的原理是通過合適的氣體組成替換包裝內的氣體環境，并利用包裝材料的阻氣性和透氣性，使食品始終處于穩定的適宜氣體環境中，以抑制微生物的生長繁殖和酶促反應，抑制新陳代謝從而達到延長保質期的目的[4-6]。氣調包裝技術因能有效保持肉類新鮮且產生的副作用小而備受青睞[7]。以雞肉為代表的冷鮮白肉類產品對色澤的要求低于紅肉類（豬肉、牛肉）產品，因此氣調保鮮主要以二氧化碳和氮氣為主。Patsias等[8]的研究表明，4 ℃冷藏條件下90% CO2/10% N2的氣調包裝方式可使冷鮮雞肉貨架期至少延長至20 d，與托盤包裝相比延長了6 d以上。Jiménez等[9]發現70% CO2/30% N2、4 ℃的貯藏條件使冷鮮雞的貨架期得到顯著延長。Latou等[10]將冷鮮雞肉在1 g/100 mL的殼聚糖中浸泡1.5 min后，再運用70% CO2/30% N2于4 ℃下進行貯藏，結果使貨架期由5 d延長至14 d。Esmer[11]、Gill[12]等研究證實，在低溫不利條件下，雖然大多數微生物也能夠存活，但是假單胞菌占據主要的生長資源，它通過利用冷鮮肉中的葡萄糖和氨基酸，加速其自身的增殖；此外假單胞菌還破壞冷鮮肉的蛋白質以及胺類物質的代謝產生具有異味的含硫化合物、酯類和酸類，從而造成冷卻肉類腐敗。假單胞菌是冷鮮雞肉中的優勢腐敗菌[13-15]，熒光假單胞菌是假單胞菌中的一個典型微生物菌株；因此，重點研究氣調包裝下冷鮮雞肉中的熒光假單胞菌顯得尤為必要。目前國內外已有大量關于氣調包裝方式對冷鮮雞保鮮效果的研究，但不同二氧化碳體積分數的氣調包裝對冷鮮雞肉中優勢腐敗菌株抑制效果的研究較少。

本實驗以冷鮮雞肉源熒光假單胞菌為對象，研究不同比例二氧化碳氣調包裝對其抑制作用及對冷鮮雞肉的保鮮效果，通過測定理化及微生物指標進行綜合分析，得到較優的二氧化碳氣調比例，以期為氣調包裝在冷鮮雞肉的保鮮技術推廣應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用的冷鮮雞由江蘇立華食品有限公司提供。

熒光假單胞菌株是江蘇省農業科學院農產品加工研究所實驗室從江蘇立華食品有限公司冷鮮雞樣品中分離鑒定的典型微生物菌株。

假單胞分離瓊脂 北京陸橋技術有限責任公司；丹磺酰氯 上海藍季生物公司；腐胺標準品 美國Sigma公司；一次性醫用無菌注射器 上海楚定分析儀器有限公司；乙腈、丙酮（均為色譜純） 德國Merck公司；氨水、高氯酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉等（均為分析純） 西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

MAP-FM280型氣調包裝機系統及氣調包裝盒上海帆銘機械有限公司；JY5002型電子天平 上海良平儀器儀表有限公司；LDZX-50KBS型滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；SW-CJ-1FD型無菌操作臺 蘇州凈化設備有限公司；T25型勻漿機 德國IKA公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；OXYBABY6.0便攜式氣體測定儀 德國WITT公司；HI-9025酸度計 意大利HANNA公司；OM-09無菌均質器 上海歐蒙實業有限公司；SPX-100B-Z生化培養箱 上海博迅實業有限公司設備廠；5424R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Alliance 2695 液相色譜系統 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 原料雞胸肉的制備及預處理

隨機選取52 只已屠宰的雞（日齡為120 d），取胸肉修剪稱量，每個無菌袋包裝（50±2）g，置于干冰保溫箱中密封保存，運至南京喜悅科技股份有限公司，24 kGy劑量輻照后接近無菌狀態。取1.1節中分離出的熒光假單胞菌菌株，過夜培養，將菌液活化培養到濃度1×109CFU/mL，稀釋到適當濃度后接種到輻照后的肉樣中，使最終肉樣含菌量為103CFU/g左右，然后進行氣調包裝。本實驗選取4 種二氧化碳體積分數包裝，分別為：0%、20%、40%、60%，以保鮮膜封口作為對照，以氮氣作為補充氣體，即V（CO2）∶V（N2）分別為：0∶100（M1組）、20∶80（M2組）、40∶60（M3組）、60∶40（M4組），氣體比例用氣體測定儀測定后進行充氣包裝。將樣品置于（4±1）℃貯藏，15 d內每隔3 d分別隨機取4 盒樣品測定相關指標。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 凹陷程度的測定

將需測量的氣調包裝盒用吸水紙吸干表面水分后置放于水平位置，測量氣調包裝盒的蓋膜低于氣調包裝盒水平面最大位置處的深度即為凹陷程度。

1.3.2.2 熒光假單胞菌總數的測定

熒光假單胞菌總數參照GB 4789.2—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[16]中的方法測定，將溫度設置為25 ℃。

1.3.2.3 pH值的測定

pH值的測定參照徐益民[17]的方法，并略作修改。用插入式pH計測量肉的pH值。

1.3.2.4 揮發性鹽基氮含量的測定

揮發性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量的測定參照GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛生標準的分析方法》[18]中的微量擴散法進行。

1.3.2.5 腐胺含量的測定

腐胺含量的測定參照Lu Shilin[19]、徐振[20]等的方法，并略作修改。

腐胺標樣的制備和柱前衍生：準確稱取腐胺標準品50.0 mg，使用0.4 mol/L的高氯酸定容到50 mL，配制成1 mg/mL的標準品原液備用。取以上制備的標準品原液，用0.4 mol/L的高氯酸配制成終質量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL的6 個標準混合液，并用鋁箔包裹4 ℃避光保存備用；吸取上述制備好的腐胺標準液2 mL，依次加入0.4 mL 2 mol/L NaOH溶液、0.6 mL的飽和碳酸氫鈉溶液、4 mL的丹磺酰氯（10 mg/mL，丙酮為溶劑），然后置于40 ℃的水浴鍋中反應45 min，同時要錫箔紙包裝避光。水浴結束后加入0.2 mL氨水終止反應，去除殘留的丹磺酰氯溶液，最后用乙腈定容至10 mL。衍生后用0.22 μm的有機濾膜過濾，濾液用于分析檢測。

樣品的處理：準確稱取2.5 g待測樣品，加入10 mL 0.4 mol/L的高氯酸，利用勻漿機徹底勻漿，在10 ℃下4 000 r/min離心10 min，吸取上清液到容量瓶中，沉淀部分再加入10 mL 0.4 mol/L的高氯酸，勻漿，離心，取二次上清液加入容量瓶，最后用0.4 mol/L高氯酸定容至25 mL。取2 mL的樣液如標準溶液一樣進行柱前衍生。

色譜條件：采用Alliance 2695液相色譜系統測定，色譜柱是Agilent ZORBAX Eclipes XDB-C18，流速為1 mL/min，UV-2487紫外檢測器，檢測波長為254 nm，進樣量20 μL，柱溫30 ℃，流動相A為水，流動相B為乙腈，采用梯度洗脫程序，洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table1 Gradient elution program

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 貯藏期中不同二氧化碳體積分數氣調包裝下包裝盒凹陷程度的變化

圖1 貯藏期中不同二氧化碳體積分數氣調包裝下氣調包裝盒的凹陷程度Fig. 1 Changes in degree of concavity during storage at 4 ℃ in modified atmosphere with different concentrations of carbon dioxide

由圖1可以看出，不同處理組的凹陷程度隨著貯藏時間的延長上升，隨二氧化碳體積分數的升高而升高。第9天后，M4組的凹陷程度顯著高于與其他3 組（P＜0.05）。整個貯藏期間M3、M4組和M1組的凹陷程度均有顯著性差異（P＜0.05），而M2組與M3組均無顯著性差異（P＞0.05）。貯藏末期，M1組的外觀最好，凹陷0.25 cm，而M4的外觀最差，凹陷0.75 cm。

2.2 貯藏期中不同二氧化碳比例氣調包裝下冷鮮雞胸肉中熒光假單胞菌總數的變化

圖2 貯藏期中不同二氧化碳比例氣調包裝下冷鮮雞胸肉中熒光假單胞菌總數Fig. 2 Changes in Pseudomonas fluorescent during storage at 4 ℃ in modified atmospheres with different concentrations of carbon dioxide

熒光假單胞菌是革蘭氏陰性菌，能夠在低溫環境下生長繁殖，是導致冷鮮雞肉腐敗的主要優勢菌[21]。由圖2可知，在（4±1)℃溫度下貯藏，不同處理組的熒光假單胞菌總數隨著貯藏時間的延長上升，隨二氧化碳體積分數的升高而下降，說明二氧化碳氣調包裝能抑制熒光假單胞菌的生長繁殖。樣品的初始接菌數為2.89（lg（CFU/g）），其中對照組熒光假單胞菌總數增長最快，在貯藏的第15天，熒光假單胞菌總數達到6.98（lg（CFU/g）。貯藏6 d后，M4組雞胸肉中熒光假單胞菌總數顯著低于其他組（P＜0.05），說明60% CO2氣調包裝抑菌效果最好，這是因為熒光假單胞菌為嚴格好氧菌，與Seydim[22]、Chouliara[23]等的研究結果相一致。M2組和M3組對熒光假單胞菌的抑菌效果相近，無顯著性差異（P＞0.05）（除貯藏12 d外）。

2.3 貯藏期中不同二氧化碳比例氣調包裝下冷鮮雞胸肉中pH值的變化

表2 貯藏期中不同二氧化碳比例氣調包裝下冷鮮雞胸肉中pH值Table2 Changes in pH value of chilled chicken during storage at 4 ℃in modified atmospheres with different concentrations of carbon dioxide

pH值是測定雞肉時重要和常見的指標之一，它對雞肉的貯藏有著重要的影響[24]。如表2所示，在15 d的貯藏過程中，5 個處理組樣品的pH值始終在5.59～6.25內，在整個貯藏期間，M2和M3組之間無顯著性差異（P＞0.05），這與Al-Nehlawi[25]和Economou[26]等的研究結果相一致。研究表明，導致雞肉pH值變化的原因有很多，高濃度二氧化碳導致有少部分溶解在肉的表面，從而導致pH值改變[24]，而有關研究表明二氧化碳在樣品包裝結束的24 h后不再溶解。也有相關研究表明，氣調包裝中二氧化碳的溶解對樣品pH值變化無顯著影響[27]。

2.4 貯藏期中不同二氧化碳比例氣調包裝下冷鮮雞胸肉中TVB-N含量

圖3 貯藏期中不同二氧化碳比例氣調包裝下冷鮮雞胸肉中TVB-N含量Fig. 3 Changes in TVB-N content of chilled chicken during at 4 ℃ in modified atmospheres with different concentrations of carbon dioxide

由圖3可以看出，在整個貯藏過程中，TVB-N含量隨貯藏時間的延長上升，隨二氧化碳體積分數的升高而下降，M4、M3、M2、M1和對照組樣品的TVB-N含量從初始的7.70 mg/100 g，分別增長到17.15、18.20、19.95、22.75、25.90 mg/100 g，M4、M3組與對照組相比，均能抑制TVB-N的產生，且這兩個處理組的TVB-N含量無顯著性差異（P＞0.05），且M4組在貯藏過程中均顯著低于其他組（P＜0.05）；貯藏9～12 d，M2組和M3樣品中TVB-N含量無顯著差異（P＞0.05）。熒光假單胞菌利用氨基酸作為生長基質，產生含硫化合物、胺類等有異味的物質，同時造成TVB-N含量的升高[28]，由圖2可知，高體積分數的二氧化碳可抑制熒光假單胞菌的生長繁殖，因此也可抑制TVB-N的產生。

2.5 貯藏期中不同二氧化碳比例氣調包裝下冷鮮雞胸肉中腐胺含量的變化

表3 貯藏期中不同二氧化碳比例氣調包裝下冷鮮雞胸肉中腐胺含量的變化Table3 Changes in putrescine content during storage at 4 ℃ in modified atmospheres with different concentrations of carbon dioxide mg/kg

不同二氧化碳氣調包裝下冰鮮雞肉的腐胺含量隨貯藏時間的變化如表3所示，在整個貯藏期間，腐胺的含量不斷增加（P＜0.05）。結果顯示：貯藏15 d后，不同處理組樣品中的腐胺含量均顯著增加（P＜0.05），對照組、M1、M2、M3和M4組樣品的腐胺含量由初始的2.58 mg/kg分別增加到28.99、23.63、16.95、14.95 mg/kg和11.01mg/kg，M4組樣品的腐胺含量最低，與其他組相比均有顯著性差異（P＜0.05）；這說明高濃度的二氧化碳氣調包裝方式能有效抑制冷鮮雞腐胺的產生，從而延長貨架期。M3和M2組的腐胺含量無顯著性差異（P＞0.05），但顯著低于對照組（P＜0.05）。

3 討 論

雞肉營養豐富，具有高蛋白、低脂肪，且水分活度高的特點，是微生物生長繁殖的天然“沃土”；因此，冷鮮雞肉極易腐敗變質，保質期短，這嚴重制約了冷鮮雞肉的生產、流通和銷售。有關研究表明：氣調包裝能延長冷鮮雞的貨架期[29]。由于二氧化碳氣體能溶解在冷鮮雞胸肉表面[30]，引起蓋膜塌陷，影響氣調包裝盒外觀，進而影響消費者的購買欲，所以氣調包裝盒里易溶于水的氣體應盡可能少。前期的研究實驗發現100%和80%的二氧化碳比例氣調包裝凹陷程度嚴重，故本實驗未設置這兩個比例。

微生物是引起冷鮮肉腐敗變質的主要原因，冷鮮肉的貨架期與其初始表面的污染程度有著密切的聯系[31]，即冷鮮肉表面初始微生物數量越大，污染越嚴重，其變質速率越快。

TVB-N是指外界微生物污染食品后，隨著微生物生長繁殖并進入肉品的深層組織，在酶和細菌的作用下引起蛋白質脫羧、脫氨作用分解而形成的產物[32]。肉樣中的TVB-N含量隨著腐敗的進行而逐漸增加，與肉品腐敗程度成正比，因此常用來鑒定肉品的新鮮度[33]。TVB-N具有揮發性，在37 ℃堿性溶液釋出，揮發后吸收于吸收液中，可用標準酸溶液滴定來計算含量。GB 16869—2005《鮮、凍禽產品》[33]規定的鮮、凍禽產品中TVB-N含量不得超過15 mg/100 g。Economou等[26]同樣指出二氧化碳氣調包裝方式對冷鮮雞肉中TVB-N的產生有著顯著抑制作用。

腐胺是在鳥氨酸脫羧酶作用下脫羧的產物，具有腐臭氣味，是評價肉類鮮度的重要指標之一[34-35]。Balamatsia等[36]測定了冷鮮肉整個貨架期中生物胺含量的變化，其研究結果表明腐胺與腐敗微生物之間有著密切的聯系。

4 結 論

本研究以冷鮮雞在（4±1）℃貯藏條件下，從氣調包裝盒的凹陷程度和肉的熒光假單胞菌落總數、pH值、TVB-N含量、腐胺含量這5 項指標進行綜合評價，比較不同體積分數二氧化碳氣調包裝對冷鮮雞肉中熒光假單胞菌抑制效果的影響。結果表明：凹陷程度隨著貯藏時間的延長上升，隨二氧化碳體積分數的升高而升高，而熒光假單胞菌總數、TVB-N和腐胺含量隨著貯藏時間的延長上升，隨二氧化碳體積分數的升高而下降，M4組的保鮮效果最好，但是M4組氣調包裝盒的凹陷程度顯著高于其他3 組，影響產品的外觀。M2組的氣調包裝盒凹陷程度、TVB-N（貯藏9～12 d）和腐胺含量與M3組無顯著性差異，能達到同樣的保鮮效果。此外，同體積的二氧化碳成本高于氮氣。整體來看，（4±1）℃貯藏條件下，20%～40%的二氧化碳包裝方式能抑制冷鮮雞肉中假單胞菌的生長。本研究為冷鮮雞保鮮、防腐提供了參考。