高、低侵襲性肝癌干細胞模型的建立及生物學特性鑒定

黎運呈，曾芳，丁賢君，李世波

（1.舟山醫院 感染科，浙江 舟山 316000；2.舟山市婦幼保健院 產前診斷實驗室，浙江 舟山316004）

肝癌是成人肝臟最常見的原發性惡性腫瘤，也是全世界最常見的惡性程度最高的實體瘤之一，其病死率位列第三[1-2]。在同一類型的腫瘤中，癌干細胞（cancer stem cells，CSCs）仍然具有異質性且可能存在不同侵襲轉移能力的CSCs亞群。有學者推斷肝癌是肝癌干細胞（liver cancer stem cells，LCSCs）增殖和分化形成的腫瘤器官，LCSCs的殘存是肝癌復發的根源，且至少部分肝轉移癌的形成應當由LCSCs來完成[3]。有研究者認為LCSCs是肝癌組織侵襲、轉移的基礎和源頭[4]。本研究擬在前期研究[5]基礎上，以高遷移肝癌細胞系（HCCLM3）為研究對象，建立高侵襲性肝癌干細胞（high-invasion liver cancer stem cells，H-ILCSCs）和低侵襲性肝癌干細胞（low-invasion liver cancer stem cells，L-ILCSCs）模型并進行生物學鑒定，為肝癌侵襲和轉移的研究探索新的方向。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：NOD-SCID免疫缺陷鼠（6～8周齡）購自中國科學院上海實驗動物中心（動物合格證號：20150005）。Mat-rigel膠和流式抗體購自美國BD公司。Transwell小室購自美國Corning公司。CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。CD133、CD44、CD90磁珠購自德國Miltenyi公司。B27購自美國Gibco公司，表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）購自美國PeproTech公司。

1.1.2 細胞培養：人高遷移肝癌細胞系HCCLM3、正常肝細胞HL-7702購自上海中國科學院典型培養物保藏中心，其中HL-7702細胞是第6代。肝癌細胞HCCLM3培養：DMEM培養基加10%胎牛血清；HL-7702培養：RPMI-1640培養基加10%胎牛血清；H-ILCSCs和L-ILCSCs培養：DMEM培養基98%，B27生長因子2%，再加入EGF/bFGF，使其終濃度為20 ng/mL。所有細胞均在37 ℃，5% CO2培養箱條件下培養。

1.2 方法

1.2.1 Transwell侵襲實驗分離高、低侵襲性HCCLM3細胞：參照TIE等[6]的操作方法，首先分離得到高（下室細胞）/低（上室細胞）遷移能力的HCCLM3細胞。將高遷移能力的HCCLM3細胞懸液加到Transwell小室（涂Matrigel膠）上室，24 h后，取出下室細胞，獲得高侵襲能力的HCCLM3細胞；將低遷移能力的HCCLM3細胞懸液加到Transwell小室（涂Matrigel膠）上室，24 h后，取出上室細胞，獲得低侵襲能力的HCCLM3細胞。

1.2.2 免疫磁珠法分選獲得H/L-ILCSCs：采用免疫磁珠分選法以CD133+為分子標志分離上述高、低侵襲性HCCLM3細胞中的干細胞。參照Miltenyi公司試劑盒說明書，將高、低侵襲能力HCCLM3肝癌細胞分別懸于500 μL的分選Buffer，制備成1×108/mL的單細胞懸液，然后在細胞懸液中加入CD133磁珠微粒100 μL，4 ℃避光孵育30 min，緩沖液沖洗細胞并離心，棄上清，重懸細胞進行H/L-ILCSCs分選。1.2.3 流式細胞儀檢測H/L-ILCSCs表面標志分子：參考試劑盒說明書，以CD133+、 CD90+、 CD44+為LCSCs表面標志，將分選后的H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702細胞用PBS洗滌2次后重懸，調整細胞密度為1×107/mL。實驗組細胞分別加入CD133-PE、CD90-PE、CD44-APC等抗體5 μL，對照組分別加入同型對照抗體5 μL，混勻后4 ℃避光孵育30 min。加入PBS清洗細胞3次，多聚甲醛固定混勻，上機檢測CD133+、CD90+、CD44+的表達量，實驗組重復檢測3次。

1.2.4 H-ILCSCs和L-ILCSCs的鑒定及侵襲特性分析：①CCK-8法檢測生長增殖能力：收集H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702細胞單細胞懸液，分別調整濃度至5×104/mL。取5塊96孔板接種細胞，每孔加細胞懸液100 μL，每組設平行復孔3個。分別在6、12、24、36、48 h隨機選取96孔板，10 μL的CCK-8試劑加入各孔，繼續孵育4 h，酶標儀于波長490 nm處測定各孔吸光度值，并取平均值。②Transwell腫瘤侵襲實驗：取分離得到的對數生長期H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702細胞，將細胞濃度調整至1×105/mL，吸取250 μL細胞懸液，加入Transwell小室（涂Matrigel膠），上室加入含0.5%胎牛血清的DMEM培養基，下室加入含20%胎牛血清的DMEM培養基。每組細胞重復5個樣本。37 ℃孵育48 h后，用棉簽去除上層小室中未侵襲遷移的細胞。然后將侵襲至下層的細胞，先用70%甲醇固定10 min，空氣干燥后，用0.1%結晶紫染色，并于顯微鏡下計數，計算PET膜下表面的侵襲細胞數，取5個視野計數平均值（%）。③平板克隆形成實驗：取對數生長期H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702，梯度倍數稀釋細胞懸液，取含2 mL培養基的六孔板，每孔接種100個細胞，細胞吹散均勻后繼續培養，每周換液2次，10 d后終止培養。棄上清后PBS洗2次，加4%多聚甲醛固定15 min。然后去固定液，加適量GIMSA染液染色20 min，計數大于10個細胞的克隆數。④免疫缺陷裸鼠體內成瘤實驗：取對數生長期的H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702細胞，消化吹散制成單細胞懸液，用不含血清的PBS洗2次后，PBS重懸。體內實驗分為4組，每組6～8周齡的NOD/SCID裸鼠共3只。按照1:1的比例與Matrigel混合，分別皮下接種1×107/mL上述細胞，2周后開始測量，隔天觀察1次。記錄皮下移植瘤形成時間及生長速度，并測量瘤體的長徑和短徑。

1.3 統計學處理方法 應用SPSS13.0軟件進行數據統計。所得數據用±s表示，實驗重復至少3次。2組均數比較采用t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞CDl33+、CD90+、CD44+表面分子標志的表達 由表1可知，與正常肝細胞HL-7702相比，H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3細胞表面標志分子CDl33+、CD90+、CD44+的表達差異均有統計學意義（P＜0.01）。H-ILCSCs和L-ILCSCs中CD133+細胞表達比例均在90%以上，說明免疫磁珠分選純度很高。此外，CD133+細胞比例在H-ILCSCs和L-ILCSCs間差異無統計學意義（P＞0.05），而H-ILCSCs和LILCSCs中CD133+細胞比例均高于HCCLM3細胞（P＜0.01）。H-ILCSCs表面標志CD90+、CD44+的表達均高于L-ILCSCs和HCCLM3細胞，差異有統計學意義（P＜0.01）。而L-ILCSCs和HCCLM3細胞CD90+、CD44+的比例差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組細胞表面標志CDl33+、CD90+、CD44+的陽性表達率（n=3，±s，%）

表1 各組細胞表面標志CDl33+、CD90+、CD44+的陽性表達率（n=3，±s，%）

與HL-7702比：aP＜0.01；與HCCLM3比：bP＜0.01；與L-ILCSCs比：cP＜0.01

組別 CD133+ CD90+ CD44+H-ILCSCs 94.57±1.96ab 92.16±1.55abc 91.69±0.70abc L-ILCSCs 93.39±0.99ab 12.25±1.10a 10.88±1.64a HCCLM3 16.78±3.06a 10.51±1.44a 9.52±1.65a HL-7702 1.49±0.46 1.51±0.80 1.43±0.52

2.2 各組細胞的生長增殖能力 CCK-8法檢測連續培養6、12、24、36、48 h后的吸光度值，結果顯示：隨著時間的延長，H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702細胞的生長增殖能力逐漸增高；在相同的時間點，H-ILCSCs的吸光度值明顯高于LILCSCs、HCCLM3、HL-7702細胞，差異有統計學意義（P＜0.05），HCCLM3的吸光度值明顯高于L-ILCSCs和HL-7702細胞，差異有統計學意義（P＜0.05），而L-ILCSCs和HL-7702細胞生長增殖能力差異無統計學意義（P＞0.05）。因此，L-ILCSCs、HL-7702的增殖能力最弱，而H-ILCSCs的細胞增殖能力最強。見圖1。

圖1 H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702細胞的生長增殖曲線圖

2.3 各組細胞的侵襲能力 取相同細胞密度的H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702細胞進行Transwell小室侵襲實驗，結果發現，HCCLM3、HL-7702、H-ILCSCs和L-ILCSCs細胞平均穿膜數分別是209±36、44±12、488±6、45±8。H-ILCSCs的穿膜數是正常HCCLM3細胞的2倍多，是L-ILCSCs的近10倍，差異具有統計學意義（P＜0.05）。HCCLM3的穿膜數是L-ILCSCs和正常HL-7702細胞的近5倍，差異有統計學意義（P＜0.01）。而L-ILCSCs與HL-7702細胞的平均穿膜數差異無統計學意義（P＞0.05）。因此，HILCSCs侵襲轉移能力最強，L-ILCSCs和HL-7702細胞的侵襲能力最弱，見圖2。

2.4 各組細胞的克隆形成能力 分選后的H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702細胞置于相應的培養基中培養。H-ILCSCs細胞懸浮生長，5～7 d后，可見數十個細胞呈球形聚集生長；隨著培養時間的延長，球體逐漸增大，形態大小各不相同；到第10天時形成典型的腫瘤球，且相對致密。HCCLM3可以形成腫瘤球，但球體明顯較少，且球塊不大。而LILCSCs和HL-7702細胞未見腫瘤球形成。因此，在相同細胞密度下，H-ILCSCs的克隆形成能力明顯高于HCCLM3細胞，而L-ILCSCs和HL-7702細胞不能形成腫瘤球。見圖3。

圖2 Transwell侵襲實驗比較H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702的侵襲轉移能力（結晶紫染色，×200）

2.5 接種各組細胞的免疫缺陷動物成瘤能力 接種相同H-ILCSCs和HCCLM3細胞數量的裸鼠，在2周后可觀察到開始形成移植瘤，成瘤率為100%，而接種L-ILCSCs、HL-7702細胞的裸鼠未見明顯的瘤體。以1×107/mL細胞密度接種，H-ILCSCs和HCCLM3形成的移植瘤體積均隨著時間增加而逐漸增大，而HILCSCs成瘤潛伏期相對要短，且生長速度更快。第1、第3、第5、第7、第9天測量時，HCCLM3形成的移植瘤體積均大于HCCLM3細胞，差異有統計學意義（P＜0.05）。說明H-ILCSCs相比HCCLM3、L-ILCSCs、HL-7702細胞具有更強的成瘤能力。見圖4和表2。

3 討論

上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在腫瘤發生、侵襲、轉移和復發中起著關鍵作用，是上皮來源癌細胞獲得侵襲和轉移特性的過程。有學者[7-8]認為EMT與CSCs關系密切，分化成熟的癌細胞能夠通過EMT獲得干細胞特性。近年研究也報道，EMT與CSCs樣特性獲得存在密切關聯，二者通過TGF-β、Notch、Wnt/β-catenin、FGF、PI3k/Akt、Hedgehog等多種信號通路及信號串話調控網絡，促進了腫瘤的侵襲、轉移及復發[9]。因此，本課題組采用Transwell侵襲小室，人工模擬EMT過程，從肝癌細胞HCCLM3中分離出高、低侵襲性肝癌細胞，培養富集后，以CD133+為表面標志進行磁珠分選，分別獲得H-ILCSCs和L-ILCSCs細胞，并檢測了H/L-ILCSCs干細胞表面標志物CD133+、CD90+、CD44+的表達情況，最后進一步與高遷移性肝癌細胞HCCLM3和正常肝細胞HL-7702相比較，鑒定其生長增殖、體外侵襲、平板克隆形成和體內裸鼠成瘤能力等生物學特性。

圖3 H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702在無血清培養基中腫瘤球的形成情況（GIMSA染色，×200）

圖4 接種H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702細胞的免疫缺陷動物的成瘤能力（移植1×107/mL細胞，成瘤后第9天觀察）

表2 接種H-ILCSCs和HCCLM3細胞的免疫缺陷動物移植瘤體積比較（n=3，±s，mm3）

表2 接種H-ILCSCs和HCCLM3細胞的免疫缺陷動物移植瘤體積比較（n=3，±s，mm3）

與HCCLM3比：aP＜0.05，bP＜0.01

組別 第1天 第3天 第5天 第7天 第9天HCCLM3 102.18±40.40 174.54±92.45 215.88±123.45 366.73±163.63 585.60±69.62 H-ILCSCs 316.43±28.91a 507.40±27.95a 785.37±107.86a 1 086.16±106.02a 1 445.69±39.99b

分選后H-ILCSCs和L-ILCSCs細胞表面分子標志CD133+細胞比例分別為94.57%±1.96%和93.39%±0.99%，說明磁珠分選純度很高。H-ILCSCs細胞表面標志CD90+、CD44+細胞比例分別為92.16%±1.55%和91.69%±0.70%，與HCCLM3和HL-7702細胞比較差異有統計學意義（P＜0.01），說明CD133+、CD90+、CD44+可以作為H-ILCSCs的分選標志物，這與BAHNASSY等[10]觀點一致。此外，L-ILCSCs細胞CD133+細胞比例和H-ILCSCs組差異無統計學意義，而其CD90+、CD44+細胞的比例明顯低于H-ILCSCs細胞，與HCCLM3細胞差異無統計學意義，說明L-ILCSCs表達低水平的干性相關分子CD90+和CD44+，LCSCs表面分子標志的表達可能具有異質性。這與WRIGHT等[11]的觀點相同，他們在對Brcal基因缺陷乳腺癌小鼠的研究中發現，來源于該類乳腺癌的細胞中含有2種不同表型的CD44+/CD24-和CD133+亞群細胞，都具有CSCs樣特征，且這2種表型的細胞沒有重疊，推測CSCs具有異質性。

在增殖實驗中，H-ILCSCs的吸光度值在作用相同時間時均較L-ILCSCs、HCCLM3、HL-7702細胞明顯增高，體現了最強的體外增殖能力，而L-ILCSCs生長增殖能力明顯低于HCCLM3細胞，與HL-7702細胞增殖能力無統計學差異，可見即使是同一種腫瘤內，CSCs可能存在不同增殖能力的亞群干細胞；在Transwell腫瘤侵襲實驗中，H-ILCSCs侵襲轉移能力最強，遠高于L-ILCSCs、HCCLM3、HL-7702細胞，而L-ILCSCs侵襲能力明顯低于HCCLM3細胞，與HL-7702細胞無統計學差異，可見，LCSCs中可能存在不同侵襲轉移能力的CSCs亞群。這與BRABLETZ等[12]、HERMANN等[13]和VISVADER等[14]的觀點類似，他們提出了靜止性CSCs和轉移性CSCs的概念，認為CSCs具有異質性，腫瘤發生和轉移的主力“種子”是具有高侵襲和轉移潛能的CSCs導致的，腫瘤轉移是具有轉移能力的CSCs內在特性的表現，它決定了惡性腫瘤的演進、復發和轉移，而靜止性CSCs負責維持原發瘤的生長，不具有遷移和侵襲能力。本研究平板克隆形成和免疫缺陷動物成瘤能力實驗中，HILCSCs和HCCLM3細胞形成的移植瘤體積均隨著時間的增加而逐漸增大，且H-ILCSCs裸鼠成瘤潛伏期相對較短，生長速度更快，形成的克隆球和移植瘤體積明顯大于HCCLM3細胞，而L-ILCSCs未見體外克隆球和體內裸鼠成瘤形成，這進一步說明LCSCs具有異質性且可能存在不同侵襲轉移能力的CSCs亞群，其中H-ILCSCs是專門負責肝癌細胞侵襲、轉移的一部分CSCs，而L-ILCSCs成為非侵襲轉移性CSCs。

綜上所述，本研究發現HCCLM3細胞中可以分離和富集不同侵襲能力的CSCs亞群（H-ILCSCs和L-ILCSCs），且H-ILCSCs的干性特征高于L-ILCSCs，而L-ILCSCs干性特征低于HCCLM3細胞。因此，本研究認為LCSCs具有異質性，可建立更為可信的HILCSCs和L-ILCSCs模型，且二種LCSCs間存在著生物學特性的差異。在肝癌防治研究或藥物篩選中，可通過靶向定位于H-ILCSCs，并力求將H-ILCSCs全部清除。