重組蛋白檢測肺炎支原體IgM抗體分析

陳曦 趙芝娜

【摘 要】目的：用重組肺炎支原體P1蛋白檢測患兒血清中IgM抗體，探討該重組蛋白抗原在肺炎支原體感染早期診斷中的應用價值。方法：被動凝集實驗檢測130例呼吸道感染患兒血清標本，從中選出35例陽性血清標本，用純化的重組肺炎支原體P1蛋白做抗原，間接ELISA方法分別檢測患兒血清中IgM和IgG抗體。結果：被動凝集實驗檢測陽性率為33.1 %（43/130）。間接ELISA試驗 MpIgM抗體的陽性率為 91.4%（32/35） ，IgG抗體的陽性率為85.7%（30/35），兩種抗體檢出的陽性率比較，差異具有統計學意義（P<0.05）且兩者陽性符合率為93.3%。結論：重組肺炎支原體P1蛋白抗原檢測IgM抗體提高了檢測的特異性和敏感性，適用于肺炎支原體感染的早期診斷。

【關鍵詞】肺炎支原體；重組蛋白；ELISA IgM抗體

【中圖分類號】R375.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】1005-0019（2018）04-0-01

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，Mp）是引起小兒呼吸道感染的常見病原菌[1]，引起的非典型肺炎起病緩慢，病程較長，感染后引起的合并癥復雜。由于對支原體分離培養困難而難以用于臨床診斷，臨床檢測主要依靠血清學方法和PCR。由于Mp細胞膜上的糖脂抗原與其它微生物及機體組織存在交叉抗原，其刺激集體產生抗體可與人的血清發生非特異性反應。因此，血清學檢測方法中所用診斷抗原的質量、檢測方法及檢測指標的不同可直接影響血清學檢測結果的敏感性與特異性。有文獻報道用構建的重組P1蛋白做抗原檢測臨床標本中IgG抗體顯示出較好的特異性[2-3]。由于IgG抗體在體內持續時間長，需雙份血清抗體滴度4倍以上升高才有診斷意義，不利于疾病的早期診斷。本研究用重組的肺炎支原體P1蛋白做抗原，ELISA檢測臨床標本中的IgM抗體，并與檢測的IgG抗體及用肺炎支原體膜抗原被動凝集試驗的檢測結果進行比較分析，以評價肺炎支原體重組P1蛋白抗原檢測IgM抗體在MP感染早期診斷中的應用價值。

1 材料與方法：

1.1 材料

35份陽性血清標本來自本院兒科門診呼吸道感染患兒被動凝聚試驗43例陽性標本中。10份正常人血清標本采自門診健康人群。Mp FH P1重組蛋白抗原，P1蛋白免疫血清由中國醫科大學王桂珍教授惠贈；被動凝集法Mp抗體檢測試劑盒系富士瑞必歐株式會社產品（SEROIDR-MYCOⅡ） 。酶標二抗（兔抗人IgM-HRP，IgG-HRP抗體）購自Sigma-aldrich。

1.2 標本采集與保存

臨床標本來源于本院兒科門診2015年11 月至2016年11月 呼吸道感染患兒130例，年齡在2-10歲，抽取靜脈血3ml，離心后分離血清，被動凝集實驗測Mp抗體，被動凝集實驗陽性標本的血清（1：80 以上）置-80℃冰箱保存。

1.3 被動膠乳凝集試驗 參照試劑盒說明書方法進行。向第一孔加入100?l血清稀釋液，第2-8孔各加25?l血清稀釋液。向第一孔加入25?l待檢血清，混勻后吸出25?l 加到第二孔，依此類推做倍比稀釋。在第1孔加入未致敏粒子（鞣化的明膠粒子1：20）25?l，第2至8孔加入致敏粒子（肺炎支原體細胞膜抗原1：40）25?l，混勻，室溫置3小時，嚴格按照說明書判定結果，將顯示陽性（+）反應圖像的最終稀釋倍數作為抗體滴度。

1.4 間接ELISA檢測患者血清中的IgM、IgG抗體 肺炎支原體P1蛋白抗原的純化與定量參見文獻[3]。采用方陣滴定法篩選出P1重組蛋白抗原的最佳包被濃度。參照文獻[1]對10份正常人血清進行ELISA檢測，測定光吸收值（OD492）。每塊酶標板均設空白孔（PBS），陰性對照孔（正常人血清）及陽性對照孔（被動凝集效價大于1：160的血清標本），血清標本均做1：100稀釋，并作雙孔檢測。根據計算出的平均OD值和標準差設定臨界值。

用純化肺炎支原體P1重組蛋白包被酶標板（含重組蛋白0.4ug/孔），加入1︰100 稀釋的待檢血清50 μl，置37 ℃水浴30 min，用洗滌液連續洗板5次，拍干，反應孔內加抗人Ig酶結合物（1：500 ）50 ?l，置37 ℃水浴30 min，洗板；每孔加入50 ?l底物液A和50 ?l底物液B，混勻，置37 ℃避光顯色10 min；每孔加入50 ?l終止液，用酶標儀測吸光度A492值；結果判定：COV=陰性對照孔平均A492值×2.1倍。樣品A492值S/COV≥1為陽性，樣品A492值S/COV<1為陰性。

2 結果

2.1 被動凝集實驗檢測結果 在臨床檢測的130 份血清標本中，被動凝集實驗判斷為陽性標本43例，陰性標本76例，疑似病例（血清效價1：40）11例，檢測陽性率為33.1 %。其中5歲以下兒童血清標本95例，血清陽性標本效價大于1：80的31例，1：40的8例。陽性率為32.6% 。6-10歲血清標本35例，陽性標本12例。陽性率34.3%

2.2 重組蛋白抗原間接ELISA檢測血清中IgM、IgG結果 本研究選擇了35份被動凝集實驗血清效價在1：80-320倍的陽性血清，用純化的P1蛋白做抗原，間接ELISA分別檢測肺炎支原體IgM和IgG抗體。

用方陣滴定法篩選重組蛋白的最佳包被濃度，重組P1蛋白的濃度為4ug/ml，采用P/N比率法對結果進行判定：

P/N = 待檢血清標本校正值 =待檢血清OD值 / 陽性參照標本OD值

陰性標本平均校正值 = 陰性血清平均OD值 / 陽性參照標本OD值

P/N≥2.1時判斷為陽性，P/N<2.1為陰性，對1.5≤P/N<2.1的標本按照同樣檢測條件重復檢測，排除假陽性。10份正常人血清平均OD值為0.0607。根據判定標準（P/N≥2.1為陽性，P/N<2.1為陰性）可知，待檢血清OD值0.1275（0.0607×2.1）以下為陰性，所測樣本中最大OD值為0.0661，屬于陰性，故10份正常人血清均為陰性，由此計算出的陰性血清標本平均校正值為0.4651。

3 討論

病原菌感染后可刺激集體產生多種抗體，其中IgM抗體在血中出現早，消失快，往往被用做病原感染早期診斷的指標。但感染產生的IgM抗體有時是非特異性的，臨床易出現假陽性反應。選用特異的抗原檢測IgM抗體，則可提高檢測的特異性。本研究用重組的P1蛋白抗原檢測IgM抗體，由于其含有肺炎支原體特異的抗原表位[2]，因此可提高檢測的特異性。本實驗用重組蛋白檢測10份正常人血清，沒有出現陽性結果。本研究檢測的130份臨床標本被動凝集實驗判斷為陽性標本43例，檢測陽性率為33.1 %。其中判定為陰性標本的病例中有11份可疑病例，血清效價為1：40 。我們選擇了35例實驗陽性患兒血清做被檢測對象，檢測陽性率為91.4%。對80例新生兒肺炎患兒進行IgM和IgG檢測，感染一周后檢測陽性率分別為97.5%和56.3%。

本實驗中檢測的IgM抗體略高于IgG抗體的檢出率，可能原因是標本采集于門診患兒，所選病例多數為5歲以下的兒童標本，標本采集時仍處于疾病的早期階段。對于有過支原體反復感染的兒童，IgM抗體檢出率會下降。Qu J等[5]對125例14-85歲疑似MP感染患者進行定量PCR、分離培養和血清學檢測抗體，結果發現，三種檢測方法在靈敏度、陽性預測值和陽性擬然比呈上升趨勢，但IgM檢測明顯低于培養法和定量PCR。除檢測方法的差異外，年長患者既往可能有過支原體感染，隨時間延長血清中IgM減少而IgG持續存在。支原體在咽部的定植存在也可產生一定濃度的IgG抗體。本研究結果顯示，應用重組蛋白做抗原，ELISA法檢測患兒血清中的IgM抗體，可以用作小兒肺炎支原體感染的早期診斷。

參考文獻

趙芝娜，王桂珍** 董占雙 李保強。肺炎支原體P1黏附蛋白基因的克隆與表達。中國人獸共患病雜志，2005， VOL 21（6）：470-472. ISSN 1002-2694

宋煥景 王桂珍** 董占雙 劉忠順 吉兆華 周吉海 。肺炎支原體P1重組蛋白的提取純化及應用研究。微生物學雜志，2007，27（3）：107-110