利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)定向降低水稻落粒性

盛夏冰，譚炎寧，孫志忠，余東，汪雪峰，袁貴龍，袁定陽，段美娟

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128；2湖南雜交水稻研究中心雜交水稻國家重點(diǎn)實(shí)驗室，長沙410125）

0 引言

【研究意義】水稻的易落粒性狀不僅造成稻谷收獲產(chǎn)量的損失，而且不適于機(jī)械化收割。某些水稻品種（組合）因落粒性強(qiáng)導(dǎo)致收獲產(chǎn)量損失程度高達(dá)5.8%—8.6%[1]，且因水稻機(jī)械化生產(chǎn)方式的普及，使易落粒品種在實(shí)際生產(chǎn)過程中受到更嚴(yán)重的產(chǎn)量損失；因此，加強(qiáng)對水稻品種落粒性的遺傳改良對于保證水稻穩(wěn)產(chǎn)和適于機(jī)械化生產(chǎn)均具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】基因編輯是一項以核酸酶作為基礎(chǔ)工具，對生物體基因組中的特定基因進(jìn)行靶向“修飾”，從而創(chuàng)制預(yù)期目標(biāo)性狀的定向遺傳改良技術(shù)。目前常見的基因編輯技術(shù)主要有鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）[2]、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）[3]和CRISPR/Cas核酸酶（規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列，clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nucleases）[4]等為工具的3種技術(shù)體系，作為第三代基因編輯技術(shù)—CRISPR/Cas是一類來源于細(xì)菌和古細(xì)菌體內(nèi)的獲得性免疫防御系統(tǒng)[5-7]，與 ZFNs、TALENs技術(shù)相比具有更加簡單、高效等優(yōu)勢。2012年JINEK等[8]研究發(fā)現(xiàn)TypeⅡCRISPR/Cas系統(tǒng)的Cas9核酸酶結(jié)合crRNA和tracrRNA 2個RNA分子就可以切割雙鏈DNA，奠定了 CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用的理論基礎(chǔ)；2013年ZHANG 等[6]和 MALI等[9]分別在《Science》雜志上發(fā)表了2篇基于CRISPR/Cas9技術(shù)改造人類與小鼠細(xì)胞系基因組的文章，引領(lǐng)了該技術(shù)的發(fā)展。近年來，CRISPR/Cas9技術(shù)已被成功應(yīng)用于動物[10]、植物[11-13]和微生物[14]的基因組定點(diǎn)編輯。在水稻遺傳改良中，該技術(shù)已成功實(shí)現(xiàn)了對抗性、產(chǎn)量、品質(zhì)和育性等相關(guān)基因的定點(diǎn)編輯，如XU等[15]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對抗除草劑基因BEL為靶點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，成功獲得對除草劑-苯達(dá)松敏感的突變體水稻材料；WANG等[11]對OsERF922進(jìn)行定向編輯，提高了受體水稻材料對稻瘟病的抗性；ZHOU等[12]以水稻溫敏不育基因TMS5為靶點(diǎn)，成功培育了水稻工程溫敏不育系；ZONG等[13]等利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了水稻基因組定點(diǎn)替換體系。這些成功案例的報道，使得CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在水稻定向遺傳改良中的應(yīng)用越來越廣泛。目前，多個控制水稻落粒性的主效基因/QTL已被定位在水稻基因組中不同的染色體上[16-21]。qSH1是控制水稻落粒性的主效基因之一，其在小穗基部的離層持續(xù)表達(dá)促進(jìn)了離層的形成，導(dǎo)致水稻籽粒易脫落。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在qSH1開放閱讀框 12 kb處 5′端調(diào)控區(qū)存在一個能夠影響 ABI3型轉(zhuǎn)錄因子與RY重復(fù)序列結(jié)合的SNP變異（G/T），該位點(diǎn)以基因型T存在時能阻礙qSH1的表達(dá)，從而抑制離層形成及產(chǎn)生難落粒表型；反之，當(dāng)其基因型為G時，能維持qSH1的持續(xù)表達(dá)促進(jìn)落粒。利用該SNP（TT）對易落粒品種Kasalath中的qSH1基因型進(jìn)行替換后，因近等基因系中qSH1的表達(dá)得到了明顯抑制而表現(xiàn)出了難落粒的表型[22]。王軍等[23-24]通過對江蘇、黑龍江、廣東等地區(qū)的39份落粒性極強(qiáng)的雜草稻的qSH1等落粒性主效基因的序列分析，證明qSH1是控制這些地區(qū)雜草稻極易落粒表型的主效基因且該SNP位點(diǎn)都表現(xiàn)出一致的“GG”基因型。此外，研究發(fā)現(xiàn)qSH1對其他落粒性控制位點(diǎn)間存在上位效應(yīng)和互作關(guān)系。ONISHI等[25]研究來自23份不同水稻資源的3個水稻落粒性基因（qSH1、qSH3和qSH4即Sh4），發(fā)現(xiàn)在qSH3和qSH4存在時，qSH1的突變可顯著地把易落粒表型轉(zhuǎn)變?yōu)殡y落粒，由此說明qSH1對其余 2個水稻落粒性基因具有明顯的上位效應(yīng)。ZHOU等[21]通過原位雜交解析3個與水稻離層發(fā)育相關(guān)的主效基因（qSH1、Sh4和SHAT1）的遺傳關(guān)系，發(fā)現(xiàn)qSH1在幼穗分化后期開始表達(dá)，并作用于Sh4、SHAT1的下游，通過維持其穩(wěn)定表達(dá)，從而促進(jìn)小穗離層結(jié)構(gòu)的形成。【本研究切入點(diǎn)】前人對水稻落粒性基因/QTL的定位及關(guān)聯(lián)分析表明，qSH1是控制水稻落粒性的關(guān)鍵主效基因，而傳統(tǒng)的遺傳改良的方法存在效率低、耗地多及不定向等不足。利用基因編輯技術(shù)對水稻落粒性主效基因qSH1進(jìn)行定點(diǎn)編輯，可從分子遺傳學(xué)層面定向、高效地改良水稻易落粒性這一復(fù)雜農(nóng)藝性狀。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究選取了一個綜合性狀優(yōu)良但易落粒的大穗型雜交稻骨干親本 HR1128為受體材料，以落粒性基因qSH1為靶點(diǎn)，利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)編輯，定向改良其落粒性過強(qiáng)的不足。以期為保證水稻穩(wěn)產(chǎn)和機(jī)械化生產(chǎn)創(chuàng)制重要的材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以HR1128為轉(zhuǎn)化受體親本，2014—2017開展常規(guī)的轉(zhuǎn)基因試驗，轉(zhuǎn)基因水稻材料種植于湖南雜交水稻研究中心長沙轉(zhuǎn)基因試驗基地，常規(guī)田間種植及水肥管理。

pYLgRNA-U3/U6a載體及pCRISPR/Cas9表達(dá)載體由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光院士惠贈，試驗所用引物（電子附表 1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，測序由湖南擎科生物技術(shù)有限公司完成，BsaⅠ、T4 DNA ligase、KOD FX分別購置于NEB、寶生物工程（大連）有限公司、東洋紡（上海）生物科技有限公司，其余分子試劑均購置于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 靶點(diǎn)設(shè)計與CRISPR/Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建

理論上，在基因的編碼區(qū)域或者5′-UTR區(qū)域進(jìn)行編輯可能改變基因翻譯后的蛋白產(chǎn)物結(jié)構(gòu)或影響該基因的表達(dá)水平，是失活基因功能或抑制基因表達(dá)的2種基本策略。根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)識別原型間隔序列毗鄰基序（protospacer adjacent motif，PAM）上游約20個核苷酸序列的特點(diǎn)，在水稻落粒性基因qSH1（LOC_Os01g62920）上設(shè)計了 2個靶位點(diǎn)，分別命名為 qSH1-T1和 qSH1-T5（圖 1-A）（qSH1-T1 序列 5′-GCGCCATGTCGTCCGCCGCT-3′，PAM 序列為 5′-GGG-3′，qSH1-T5 序列 5′-ACATGGC GCGCACGCACGTA-3′（qSH1反向互補(bǔ)鏈），PAM序列為5′-CGG-3′）。2個靶點(diǎn)的主要靶標(biāo)區(qū)域分別在qSH1第一個外顯子區(qū)域和 5′-UTR區(qū)域，以便獲得qSH1生物學(xué)功能喪失或表達(dá)量降低的突變體后代。靶點(diǎn)的特異性通過信息網(wǎng)站Cas-OFFinder和NCBI中水稻基因組BLAST對比分析驗證，發(fā)現(xiàn)2個靶點(diǎn)不會或不易引起脫靶效應(yīng)。

參照 MA等[26]的方法構(gòu)建雙靶點(diǎn)表達(dá)載體pYLCRISPR/Cas9- qSH1-T51。（1）構(gòu)建含qSH1-T5和qSH1-T1雙靶點(diǎn)的pYLgRNA-U3、pYLgRNA-U6a載體：分別合成帶有黏性末端的寡鏈靶點(diǎn)引物 qSH1-T5F/qSH1-T5R和qSH1-T1F/qSH1-T1R。將2對寡鏈靶點(diǎn)引物變性后冷卻至室溫完成退火，然后將退火后的2個片段分別接連到pYLgRNA-U3和pYLgRNAU6a載體上，并利用PCR分別擴(kuò)增獲得含有qSH1-T5和qSH1-T1靶點(diǎn)的gDNA表達(dá)盒U3-qSH1T5-gRNA和U6a-qSH1T1-gRNA；（2）構(gòu)建含qSH1-T5和qSH1-T1靶點(diǎn)片段的pYLCRISPR/Cas9表達(dá)載體：用接頭引物b1/B2和 b2/BL分別對 U3-qSH1T5-gRNA和 U6aqSH1T1-gRNA表達(dá)盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用BsaⅠ酶、T4 DNA ligase將所有擴(kuò)增產(chǎn)物與pYLCRISPR/ Cas9-MT表達(dá)載體同時進(jìn)行酶切和連接，構(gòu)建pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51表達(dá)載體。（3）轉(zhuǎn)化及測序驗證：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落擴(kuò)繁培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒DNA后用AscⅠ酶切鑒定檢測，并挑選AscⅠ酶切正確的質(zhì)粒DNA用檢測引物SP1/SP2（電子附表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增產(chǎn)物送湖南擎科生物技術(shù)有限公司測序。將通過酶切和測序驗證正確的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105。

圖1 gRNA靶位點(diǎn)及pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51表達(dá)載體組裝示意圖Fig. 1 Target sites of the gRNA in the qSH1 gene and construction of the pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51 vector

1.3 轉(zhuǎn)基因陽性植株的獲得

使用構(gòu)建好的陽性農(nóng)桿菌株轉(zhuǎn)化水稻品種HR1128的愈傷組織，用潮霉素篩選得到的再生組培苗，即為T0代植株（水稻遺傳轉(zhuǎn)化委托武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司完成）。采用 CTAB法[27]提取 T0代植株的基因組 DNA，用潮霉素基因特異引物 hpt-F1/hpt-R1（電子附表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能擴(kuò)增出目的片段的植株即為T0代轉(zhuǎn)基因陽性植株。

1.4 靶位點(diǎn)檢測

為檢測靶位點(diǎn)的突變情況，跨 qSH1-T1和qSH1-T5 2個靶點(diǎn)設(shè)計靶點(diǎn)檢測引物 qSH1-JC-F1/qSH1-JC-R1（電子附表1），擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小約為671 bp。用qSH1-JC-F1/qSH1-JC-R1對T0代轉(zhuǎn)基因陽性株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物送湖南擎科生物技術(shù)有限公司測序。利用 MAGE4.0分析測序結(jié)果，在靶點(diǎn)位置出現(xiàn)雙峰、套峰的植株即為T0代突變植株。再將突變植株的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，隨機(jī)挑選10個單克隆測序，測序結(jié)果與野生型序列進(jìn)行對比以分析突變類型及基因型。

1.5 無T-DNA元件的qsh1突變系的獲得

篩選得到的 T0代突變株自交結(jié)實(shí)后得到 T1代種子，將 T1代種子播種成苗移栽后提取葉片基因組DNA，用hpt-F1/ hpt-R1引物（電子附表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增不出目的條帶的植株即為無 T-DNA成分的T1代單株。再對上述單株用qSH1-JC-F1/ qSH1-JCR1（電子附表1）引物進(jìn)行靶點(diǎn)PCR擴(kuò)增并測序分析，篩選純合突變單株即為T1代無T-DNA成分的qsh1純合突變體。對上述篩選的qsh1純合突變體自交加代，獲得T2代qsh1突變系。

1.6 潛在脫靶位點(diǎn)分析

利用NCBI、Gramene的BLAST工具選取Oryza sativa IndicaGroup為參考序列，篩選與每個sgRNA序列匹配度大于或等于15 bp且3′端具有NGG的位點(diǎn)作為潛在脫靶位點(diǎn)，評估各個靶位點(diǎn)的脫靶效應(yīng)。每個潛在脫靶位點(diǎn)分別檢測T0代、T1代轉(zhuǎn)基因陽性植株。

1.7 落粒性測定分析

采用隨機(jī)分區(qū)設(shè)計種植無T-DNA成分的qsh1突變系及HR1128野生型對照，3個重復(fù)，每個小區(qū)中各株系種5行，每行8株。每個株系黃熟后取中間5株的主穗測定其穗尖籽粒的脫落拉力，每穗各測定10粒，每個株系設(shè)置3個重復(fù)。脫落拉力采用拉力計測定，各株系測定的拉力值采用SPSS13.0計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并利用單因素方差分析法比較不同株系間拉力值的差異，顯著性差異水平為P≤0.05，計算得出的平均拉力值與該株系的落粒性呈負(fù)相關(guān)性。

1.8 qsh1突變系主要穗部農(nóng)藝性狀考查與分析

于成熟期，選擇qsh1突變系和HR1128野生型材料的主穗，考查每穗總粒數(shù)、結(jié)實(shí)率并隨機(jī)稱取250粒飽滿種子的質(zhì)量換算成千粒重，每個株系各考查5個單株。獲得的數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.9 qsh1突變系qSH1相對表達(dá)量分析及編碼氨基酸序列預(yù)測分析

提取黃熟期qsh1突變系和HR1128野生型穗部總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA。利用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法分析qSH1在突變體和野生型中的表達(dá)水平，其中以qSH1-Q-F/qSH1-Q-R目的基因引物（擴(kuò)增區(qū)段位于qSH1第 2個外顯子區(qū)）、UbQ5-Q-F/UbQ5-Q-R為內(nèi)參基因引物，利用2-ΔΔCT方法計算基因相對表達(dá)量。同時，采用 MAGE4.0和DNAMAN對突變體和野生型qSH1編碼的第一個外顯子氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)一步的預(yù)測比對分析。

2 結(jié)果

2.1 qSH1靶點(diǎn)設(shè)計和pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù) CRISPR/Cas9技術(shù)的原理并結(jié)合qSH1的cDNA序列，在起始密碼子附近找到2條長度為20 bp特異性好的片段，將其設(shè)計為 2個靶點(diǎn) qSH1-T5和qSH1-T1（圖 1-A）。然后利用酶切連接、PCR等方法將qSH1-T5、qSH1-T1與gRNA表達(dá)盒連接，最后再將 2個連接成功的靶點(diǎn)-gRNA同時組裝至pYLCRISPR/Cas9-MT表達(dá)載體（圖1-B）。組裝好的表達(dá)載體 2個靶點(diǎn)-gRNA表達(dá)盒分別由OsU3和OsU6a啟動子驅(qū)動，Cas9由Ubi啟動子驅(qū)動。

2.2 T0代轉(zhuǎn)基因陽性苗的獲得及qSH1編輯情況分析

用含有 pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化HR1128，獲得T0代再生苗。載體特異引物 hpt-F1/hpt-R1（電子附表 1）檢測結(jié)果表明，獲得的20株T0代再生苗中有11株為轉(zhuǎn)基因陽性苗，轉(zhuǎn)基因陽性率為55%。再對獲得的轉(zhuǎn)基因陽性苗用靶點(diǎn)檢測引物qSH1-JC-F1/ qSH1-JC-R1（電子附表1）對qSH1靶點(diǎn)上下游區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，結(jié)果表明，有7株轉(zhuǎn)基因陽性苗在qSH1靶點(diǎn)位置發(fā)生了編輯（圖2），其中T1靶點(diǎn)的突變頻率為54.55%、T5靶點(diǎn)的突變頻率為63.64%、T1和T5靶點(diǎn)同時突變的頻率為 54.55%（T1靶點(diǎn)發(fā)生突變的單株，其在T5靶點(diǎn)都發(fā)生了突變）。

進(jìn)一步對7個突變單株靶點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，并隨機(jī)挑選10個單克隆測序分析，結(jié)果表明，qSH1的突變基因型包括純合突變、雜合突變、雙等位突變和嵌合突變，突變類型包括堿基插入、堿基缺失及堿基替換（表1）。

2.3 無T-DNA成分的qsh1突變系的獲得

為獲得不含 T-DNA成分且突變位點(diǎn)能穩(wěn)定遺傳的qsh1突變系，將7個T0代qsh1突變單株自交繁殖，構(gòu)建7個T1代qsh1突變?nèi)后w。利用hpt-F1/hpt-R1和qSH1-JC-F1/qSH1-JC-R1引物（電子附表1）對T1代突變?nèi)后w中單株的載體序列和靶點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增測序分析。發(fā)現(xiàn)在T1代植株中Cas9載體骨架和qSH1突變位點(diǎn)都發(fā)生了分離（圖 3），并篩選獲得 2種突變類型不同且無T-DNA成分的qsh1純合突變。將上述2種純合突變株自交加代，進(jìn)一步構(gòu)建2個T2代qsh1純合突變系群體，命名為17SZ01和17SZ02（圖4）。

圖2 2個靶位點(diǎn)的測序結(jié)果Fig. 2 Sequencing result for the two target sequences

表1 T0代突變體突變基因型比率、突變類型比率Table 1 The genotype ratios and mutation type ratios of T0 plants

2.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)潛在脫靶效應(yīng)的分析

根據(jù)靶位點(diǎn) qSH1-T5、qSH1-T1序列與Oryza sativa IndicaGroup參考序列的比對結(jié)果，篩選出的3個潛在脫靶位點(diǎn)。并對獲得的 T0和 T1代轉(zhuǎn)基因陽性植株46株進(jìn)行潛在脫靶位點(diǎn)PCR擴(kuò)增測序，結(jié)果比對分析發(fā)現(xiàn)，所有被檢測植株的潛在脫靶位點(diǎn)均沒有發(fā)生突變（表2）。

2.5 qSH1編輯后代落粒性的測定及主要穗部農(nóng)藝性狀的考查分析

于成熟期，采用拉力計對qsh1純合突變系17SZ01、17SZ02及HR1128野生型對照單株主穗或大分蘗穗尖部的籽粒脫落拉力進(jìn)行測定分析。結(jié)果表明，所測定的T2代qsh1純合突變系的拉力值與野生型對照相比顯著增加（拉力值分別為（116.38±15.48）g和（103.73±15.70）g），由此說明qsh1純合突變系的落粒性呈現(xiàn)顯著性降低（圖5）。同時，對qsh1突變系、HR1128野生型材料的每穗總粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重等幾項主要穗部農(nóng)藝性狀進(jìn)行考查統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，各項指標(biāo)在突變系和野生型材料間均無顯著性差異（表3）。

圖3 部分qsh1突變株T-DNA成分的PCR鑒定Fig. 3 PCR identification for the T-DNA elements of parts of the qsh1 mutants

圖4 T2代2種不同類型qsh1純合突變的突變類型分析Fig. 4 Mutation types of two types qsh1 homozygotes in T2 generation

表2 CRISPR/Cas9-qSH1-T51潛在脫靶位點(diǎn)的檢測Table 2 Mutation detections in the putative CRISPR/Cas9-qSH1-T51 off-target sites

圖5 T2代qsh1純合突變系及HR1128野生型落粒性分析Fig. 5 The seed shattering of qsh1and HR1128 in T2 generation

表3 qsh1突變系和HR1128野生型主要穗部農(nóng)藝性狀調(diào)查Table 3 Major panicle agronomic traits of qsh1 mutants and HR1128 WT

2.6 突變系qSH1的qRT-PCR檢測及氨基酸序列預(yù)測分析

對qsh1純合突變系17SZ01、17SZ02及HR1128野生型對照黃熟期穗部qSH1進(jìn)行qRT-PCR檢測并對其相對表達(dá)量進(jìn)行計算分析，發(fā)現(xiàn)與野生型對照相比，17SZ01突變系qSH1的相對表達(dá)量顯著降低（圖6），而17SZ02突變系qSH1的相對表達(dá)量無顯著差異。

同時對2個qsh1純合突變系編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測比對，發(fā)現(xiàn)17SZ01和17SZ02均由于靶點(diǎn)T1的插入突變引發(fā)qSH1第一個外顯子編碼區(qū)移碼，從而導(dǎo)致氨基酸翻譯發(fā)生改變并提前終止（圖7）。

3 討論

CRISPR/Cas9技術(shù)是目前最前沿的基因編輯技術(shù)，相對于鋅指蛋白（zinc-finger nucleases，ZFNs）和TALE核酸酶（transcription activator like effector nucleases，TALENs）技術(shù)，其具有載體構(gòu)建簡便、靶位點(diǎn)選擇廣泛及打靶效率高等優(yōu)勢，目前已成功用于水稻[11-12,15,28]、玉米[29]、小麥[30]等多種作物特定基因的定點(diǎn)編輯且多用于受體材料的定向遺傳改良。

圖6 qsh1純合突變系及HR1128野生型qSH1相對表達(dá)量Fig. 6 qSH1 relatively expression level of qsh1 mutant line and HR1128 WT

本研究利用雙靶點(diǎn)CRISPR/Cas9表達(dá)載體對水稻的qSH1進(jìn)行定點(diǎn)編輯，成功獲得一系列不同突變類型的qsh1突變體。T0代qsh12個靶點(diǎn)的突變頻率分別為 54.55%和 63.64%，突變基因型以雙等位突變頻率最高（T5、T1均為42.9%），突變類型以10 bp以內(nèi)小片段的堿基缺失為主（T5和T1分別為60.0%和40.0%），這與前人研究結(jié)果一致[31-32]。對T1代單株的靶位點(diǎn)和T-DNA元件的檢測發(fā)現(xiàn)在T1代植株中突變位點(diǎn)和T-DNA載體骨架都發(fā)生了分離，由此從T1分離群體中篩選得到不含T-DNA成分的qsh1純合突變體，并進(jìn)一步自交獲得T2代qsh1突變系。同時，對 T0和 T1代轉(zhuǎn)基因陽性植株的潛在脫靶位點(diǎn)進(jìn)行了脫靶效應(yīng)的檢測分析，發(fā)現(xiàn)被檢測的植株均未發(fā)生脫靶現(xiàn)象。

圖7 qsh1純合突變系及HR1128野生型 qSH1第一個外顯子預(yù)測氨基酸序列分析Fig. 7 Analysis of qSH1 gene the first extron putative amino acid sequences of qsh1 mutant lines and HR1128 WT

通過對黃熟后的T2代qsh1純合突變系籽粒脫落拉力的測定分析，與野生型對照相比，2個突變系落粒性有顯著性降低（籽粒脫落拉力值分別為（116.38±15.48）g和（103.73±15.70）g）。發(fā)現(xiàn) 17SZ01和 17SZ02突變系均在qSH1的第一個外顯子上發(fā)生了堿基插入，使該基因編碼區(qū)產(chǎn)生移碼突變，從而導(dǎo)致其編碼的氨基酸改變且qSH1蛋白翻譯提前終止，最終引起該蛋白不能發(fā)揮正常的生物學(xué)功能，可能是造成突變系落粒性顯著降低的主要原因。而 17SZ01突變系的qSH1表達(dá)量發(fā)生顯著下降，是否對突變系落粒性表型的改變起到增效作用？后續(xù)仍需更多不同突變類型的純合系進(jìn)行分析，以驗證推論是否正確。據(jù)報道，5′-UTR作為連接第一個外顯子和啟動子的非編碼區(qū)，該區(qū)域在基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中起著重要的調(diào)控作用，該區(qū)域的突變可直接影響啟動子活性，進(jìn)而影響下游基因表達(dá)[33-35]，所以本研究分析認(rèn)為17SZ01突變系在qSH1的5′-UTR區(qū)的缺失突變，可能引起了其調(diào)控位點(diǎn)的功能變化或喪失，影響了該基因啟動子的活性，從而導(dǎo)致了該突變系qSH1的表達(dá)量顯著下降。同時，由于第一個外顯子上的插入突變可能激活了植物體細(xì)胞內(nèi)無義介導(dǎo)的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）途徑[36]及轉(zhuǎn)基因組培操作過程中可能誘發(fā)的轉(zhuǎn)座子激活等現(xiàn)象[37]，都可能影響mRNA的穩(wěn)定性，從而造成突變系基因表達(dá)的變化。

傳統(tǒng)的遺傳改良育種技術(shù)周期長、效率低，且容易帶入連鎖累贅基因。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以快速、高效地定點(diǎn)編輯特定基因定向改良受體材料的目標(biāo)性狀，而且在自交后代中分離得到無 T-DNA成分的純合突變株系，極大地縮短了水稻遺傳改良育種的周期。本研究定點(diǎn)編輯了易落粒的大穗型秈稻品種HR1128中qSH1，并在得到的突變體后代中獲得了落粒性狀顯著降低的改良株系。目前，筆者正在將改良的突變系材料與野生型親本進(jìn)行回交選育，進(jìn)一步純化突變系后代的遺傳背景。并同時篩選更多不同突變類型的純合系，解析不同位點(diǎn)突變對降低落粒性的改良效果以挖掘最適的突變位點(diǎn)，為定向改良某些水稻品種（組合）易落粒這一復(fù)雜農(nóng)藝性狀探索了一條全新、綠色、高效的分子育種途徑。

4 結(jié)論

利用 CRISPR/Cas9技術(shù)對易落粒的雜交稻親本品種HR1128的qSH1進(jìn)行定點(diǎn)編輯，創(chuàng)制了一批qsh1突變體材料，并篩選獲得落粒性顯著降低的改良后代。這是一條全新、綠色、高效的分子育種策略。

致謝：pYLgRNA-U3/U6a載體及pCRISPR/Cas9表達(dá)載體由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光院士提供；文章的撰寫及修改得到彭彥博士、潘銀林博士的幫助，在此表示感謝。