家族性慢性小管間質(zhì)性腎病1例家系調(diào)查和基因篩查

徐海山 唐建英 許光輝

有關(guān)家族性慢性小管間質(zhì)性腎病的國內(nèi)報道很少, 但是國內(nèi)未查到慢性小管間質(zhì)性腎病家系臨床調(diào)查研究的相關(guān)文獻。有研究發(fā)現(xiàn), PAI-1、TIMP-1和Smad7基因與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生有關(guān), 但尚無這3個基因與常染色體顯性遺傳性腎小管間質(zhì)腎病(ADTKD)相關(guān)報道。為此, 作者對臨床上遇到的1例家族性慢性小管間質(zhì)性腎病進行家系調(diào)查, 并初步探索是否存在上述3個基因異常。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 莆田學(xué)院附屬醫(yī)院臨床診治發(fā)現(xiàn)1例家族性慢性小管間質(zhì)性腎病患者, 采集其家系, 成員總數(shù)為36例,累計4代。2016年和2017年2次進行家系調(diào)查, 共調(diào)查36例成員, 對其進行尿常規(guī)+沉渣鏡檢和腎功能電解質(zhì)篩查, 對部分可疑成員進行尿蛋白成分分析以進一步診斷。將調(diào)查對象分為未受累者、患者和不明確者3種表型。有下列情況之一者視為未受累者：①家系中無親緣關(guān)系的配偶, 亦視為未受累者；②年齡≥30歲, 尿檢正常和腎功能電解質(zhì)正常, 考慮該家系早發(fā)起病, 視為未受累者。有下列情況之一者視為患者：①腎臟病理證實慢性小管間質(zhì)性腎病；②出現(xiàn)ESRD, 需要或已經(jīng)進行替代治療；③尿常規(guī):對尿蛋白 (± ～ +)或尿比重異常或血清電解質(zhì)異常或高尿酸血癥者或血肌酐升高者作為疑似患者。下列情況之一者視為不明確者:①血肌酐升高, 且尿常規(guī)出現(xiàn)尿蛋白(2+～3+)；②年齡＜30歲, 尿檢正常和腎功能電解質(zhì)正常。所有受累和疑似患者均除外引起繼發(fā)性原因, 如結(jié)締組織病、反流性腎病、病毒感染、藥物等。

1.2 方法

1.2.1 提取外周血細胞基因組DNA 在獲取其知情同意后,采集了32例家系成員的外周血3～5 ml, 用SigmaDNA抽提試劑盒, 參照說明書操作步驟提取DNA, 經(jīng)濃度和A 260/280比值測定合格后-20℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計 部分外顯子引物用primerprimier 5軟件自行設(shè)計, 部分外顯子引物來自參考文獻。PAI-1、TIMP-1、smad7基因序列來自Genbank(NC_000007.14、NC_000023.11、NC_000018.10)。用相應(yīng)外顯子單側(cè)PCR擴增引物進行測序。

1.2.3 PCR反應(yīng)條件與體系 外顯子采用反應(yīng)體系為25 μl:10×PCR 緩 沖 液 2.5 μl, dNTPMixture (各 2.5 mM)2 μl,TaKaRaExTaq 酶 (5 U/μl)0.15 μl, 模板 DNA 30 ng。反應(yīng)條件 ：95℃預(yù)變性 5 min 后進入循環(huán) ：95℃變性 30 s, 退火 30 s(退火溫度參照反應(yīng)實際溫度 ), 72℃延伸 45 s, 循環(huán) 36 次 , 最后72℃延伸 10 min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物純化與測序 按照QIAquickPCR產(chǎn)物試劑盒說明書收集純化PCR產(chǎn)物, 然后用1%瓊脂糖凝膠進行電泳估算其濃度, 純化PCR產(chǎn)物以4℃保存。根據(jù)BIG dyeterminator測序試劑盒和ET-termi-nator測序試劑盒按照說明進行操作, 取適量純化PCR產(chǎn)物, 用ABI 3730自動測序儀測序(美國PerkinElmer, Appliediosystem)。為了以保證結(jié)果的可靠性, 標(biāo)本行重復(fù)和(或)雙向測序。

1.2.5 堿基序列對比及SNP數(shù)據(jù)庫搜尋 測序輸出序列后,與模版序列匹配(BLASTbl2seq)比對, 以尋找突變位點；然后人工讀序列圖再次核實(Chromas 2.31)。如發(fā)現(xiàn)堿基變異,在SNP數(shù)據(jù)庫搜尋以確認是否為單核苷酸多態(tài)性。新發(fā)現(xiàn)的堿基變異則以該家系中未受累者及其他健康人共10例為對照進行比對。

2 結(jié)果

2.1 家系的遺傳方式 該家系成員均為漢族, 腎病家族史明確, 家系圖可見圖1。圖譜分析顯示該家系遺傳方式為常染色體顯性遺傳, 即：①遺傳和性別無關(guān)：男女均可發(fā)病,男女病情嚴重程度無明顯差異；②患者父母中必有一方為受累者, 患者將異常基因傳給子女的幾率相等, 均為50%；③在連續(xù)世代中均每代均有成員發(fā)病。

2.2 家系的臨床特征 家系共有4代, 成員總數(shù)49例, 調(diào)查成員36例, 其中3代連續(xù)發(fā)病。根據(jù)本研究確定的受累患者標(biāo)準(zhǔn):共有患者5例, 未受累者12例。見圖1。

圖1 患者家系圖

2.3 先證者Ⅰ , 女性 , 21歲發(fā)現(xiàn)尿毒癥 , 血液透析 3.5年后腎移植, 現(xiàn)在腎移植已6年, 目前生化全套、尿常規(guī)、血常規(guī)均正常。先證者Ⅱ, 男性, 先證者Ⅰ的大弟弟, 14歲發(fā)現(xiàn)也已經(jīng)尿毒癥, 血液透析1年后腎移植, 現(xiàn)在腎移植已10年,2017 年 12 月血肌酐 176.8 μmol/L、尿酸 416.3 μmol/L、尿素氮 13.5 mmol/L, 尿蛋白 ±。先證者Ⅲ , 先證者Ⅰ二弟弟 , 3 年前19歲首次體檢發(fā)現(xiàn)血肌酐 136.6 μmol/L, 血尿酸446 μmol/L,尿蛋白±～1, 腎穿提示慢性小管間質(zhì)疾病, 長期服用“尿毒清、金水寶、氯沙坦”2017年12月血肌酐200.8 μmol/L、尿酸 453.8 μmol/L、尿素氮 14.9 mmol/L, 尿蛋白 1+。三位先證者均無痛風(fēng)和腎囊腫。先證者的爺爺和媽媽各自在30余歲時死于尿毒癥。

2.4 家系先證者的基因篩查結(jié)果 家系先證者PAI-1、TIMP-1、smad7三個基因的所有外顯子全部擴增成功, 產(chǎn)物純化測序后比對未發(fā)現(xiàn)基因突變。

3 討論

1971年國外報道了首例家族性慢性小管間質(zhì)性腎病,后來這類疾病曾被命名為髓質(zhì)囊性腎病、家族性間質(zhì)性腎炎、遺傳性質(zhì)性腎病等。這類疾病命名混亂, 診斷標(biāo)準(zhǔn)不一, 不便比較和深入研究。因此, 改善全球腎病預(yù)后組織(KDIGO)最近將此類疾病命名為常染色體顯性小管間質(zhì)性腎病(ADTKD), 并發(fā)布了有關(guān)ADTKD的專家共識［1］。

ADTKD的病因尚未明確, 該共識認為ADTKD的發(fā)生主要與UMOD、REN、HNF1B、MUC14個基因有關(guān), 也存在其他基因異常的可能。本病的臨床表現(xiàn)十分接近, 無論是以上4個基因中哪個突變, 均是以腎臟濃縮稀釋功能障礙為主要表現(xiàn)為；但是, 即使是同一個基因突變, 其發(fā)病年齡、病情嚴重程度、病情進展速度等均存在明顯差異。本病進入ESRD 的年齡一般在 20～80 歲［2］。

ADTKD診斷標(biāo)準(zhǔn)：患者若有典型的間質(zhì)性腎損害的臨床表現(xiàn), 同時具有明確的至少兩代直系親屬中有類似的腎病病史且符合常染色體顯性遺傳模式的家族史, 就可以診斷本病。

有關(guān)ADTKD報道甚少, 僅有個案報道, 毛文麗等［3］報道1例；但是有關(guān)其家系調(diào)查國內(nèi)報道尚無。作者研究的該例家系調(diào)查發(fā)現(xiàn), 三代均有ESRD患者, 男女都有, 其中年輕1例患者腎穿明確是慢性小管間質(zhì)性腎病, 據(jù)此符合ADTKD診斷標(biāo)準(zhǔn)。本家系都是非常年輕就發(fā)病, 很快進入ESRD, 未發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)和腎囊腫。

許多研究發(fā)現(xiàn) , PAI-1、TIMP-1和 Smad7 基因與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生有關(guān)［4,5］。但尚無這三個基因與ADTKD相關(guān)報道。作者研究發(fā)現(xiàn)此例ADTKD患者家族中PAI-1、TIMP-1和Smad7 基因并無突變, 據(jù)此作者認為這三個基因不是該本例家族性慢性小管間質(zhì)性腎病的致病基因。ADTKD的治療目前尚未有效的治療手段, 需要更多的研究去探索其發(fā)病的機制和治療。