體表擦拭取樣在兩棲動物保護遺傳學研究中的應用

艾永斌， 楊旭升， 彭衛華， 陳云梅， 徐涼燕， 羅劍， 夏云， 曾曉茂*

(1.四川申果莊省級大熊貓自然保護區管理處，四川越西616650； 2. 中國科學院成都生物研究所，成都610041；3. 中國科學院大學，北京100049)

在兩棲動物遺傳學和分子生物學的相關研究中，為了獲取DNA，常常需要獲得動物的組織樣品。早期研究往往采取損傷性取樣，即處死動物后獲取樣品。隨著人們保護意識的提高，非損傷性取樣即非損傷性基因取樣得到廣泛應用，包括剪趾法、活體組織檢查和針刺取血等方法(Maddocketal.，2014)。相比之下，非損傷性取樣既可以滿足生物學研究的要求，也在一定程度上保護了物種的生存和繁殖。

在非損傷性取樣方法中，剪趾法對兩棲動物傷害最大，主要是因為兩棲動物適應水陸兩棲的生活，棲息環境中存在大量病菌，皮膚作為免疫防御機制對于兩棲動物抵御病菌至關重要，因此，剪趾或者剪尾易導致兩棲動物死亡。Parris等(2010)在3種無尾類中比較了口腔取樣、剪趾取樣、蝌蚪剪尾取樣對動物的傷害程度，發現剪趾法對動物傷害最大，在實驗室飼養，同時用消炎藥處理傷口的前提下，非損傷性取樣后西方蟾蜍Bufoboreas的死亡率為0.35%。此外，在野外兩棲動物的監測項目中，通常會采用剪趾法作標志重捕，而剪趾會影響動物的存活率和重捕率，進而影響對整個種群數量的評估(McCarthyetal.，2009；吳軍等，2013)。

目前報道的用于兩棲動物的非損傷性取樣方法有口腔擦拭取樣和體表皮膚擦拭取樣：Poschadel和M?ller(2004)描述了在陸龜科Testudinidae、蛙科Ranidae、蠑螈科Salamandridae、蟾蜍科Bufonidae動物中通用的口腔取樣方法，即用1個小勺子輕輕打開動物口腔，然后用棉簽沾取口腔內的黏液；Broquet等(2007)在高山歐螈Triturusalpestris和無斑雨蛙Hylaarborea中驗證了口腔擦拭得到的DNA樣品可以用于微衛星分型研究；Mendoza等(2012)在卵齒蟾Eleutherodactylusjohnstonei中用棉簽擦拭表皮來獲取DNA樣品，并用16S rRNA做了分析；Guo等(2013)通過電極刺激中國大鯢Andriasdavidianus的體表，收集皮膚黏液和皮膚脫落物作為組織樣品；Maddock等(2014)在蚓螈目Gymnophiona 5個物種中嘗試了口腔擦拭、皮膚擦拭取樣，均成功獲取DNA。

迄今，采用口腔擦拭取樣在兩棲動物中應用較多，但此法受動物個體限制，小型個體或幼體不易操作。相對而言，體表皮膚擦拭取樣應用更廣泛，不受發育期的限制，適用于成體、幼體或蝌蚪期任一發育階段。但已知的皮膚擦拭取樣的研究局限于個別物種，能否普及到各類群尚不得知；另一方面，已知的取樣方法多為在實驗室對活體的操作，不適用于野外就地取樣。基于此，本研究通過比較分析，嘗試野外就地體表擦拭取樣、野外就地干燥保存、DNA高效提取等方法，對四川申果莊省級大熊貓自然保護區內的有尾兩棲類及無尾兩棲類6科10屬11種進行研究，以期驗證體表擦拭取樣在野外工作中的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

2017年4月和6月對四川申果莊省級大熊貓自然保護區(102°42′00″～102°54′17″E，28°28′13″～28°41′54″N)內的有尾類及無尾類就地隨機取樣，共計6科10屬11種，采樣信息見表1。

表1 四川申果莊省級大熊貓自然保護區物種采樣信息Table 1 Information of samples collected from Shenguozhuang Provincial Giant Panda Nature Reserve， Sichuan

注： 物種分類系統按費梁等(2009)和Frost(2017)

Note： The classification follows Feietal.， 2009 and Frost， 2017

1.2 取樣方法

1.2.1體表擦拭取樣輕輕捉住動物，就地用流溪清水沖洗干凈，取無菌棉簽在體表(背部或腹部)擦拭至棉簽濕潤，然后將棉簽置入EP管。

1.2.2口腔擦拭取樣輕輕捉住動物，就地用流溪清水沖洗干凈，用邊角圓潤的勺子輕輕打開口腔，將棉簽伸入口中，擦拭至棉簽濕潤，然后將棉簽置入EP管。

1.2.3剪趾取樣體表擦拭和口腔擦拭取樣結束后，剪取動物第二節關節處的腳趾，保存在裝有95%乙醇的EP管中，取樣完成后將動物就地釋放。

1.3 樣品的保存

棉簽擦試樣品(體表、口腔)置于密封袋中，EP管蓋敞開，袋中放硅膠，封住密封袋，待棉簽完全干燥(大約24 h)后合上EP管蓋。在野外可將樣品放置在常溫環境下(20～25 ℃)，待回到實驗室將其保存在-20 ℃。剪趾樣本回到實驗室后更換1次95%乙醇，-20 ℃保存。

1.4 DNA的提取

每個物種隨機抽取2～15個樣本，分2組提取DNA，其中一組用常規高鹽法提取，另一組用試劑盒提取。使用TIANGEN公司的口腔拭子基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(TIANamp Swab DNA Kit，DP322)，根據說明書操作獲得DNA樣品，并于-20 ℃保存。

1.5 PCR擴增

PCR擴增分別選取了16SrRNA通用引物1對、COⅠ專一引物1對以及COⅠ通用引物4對(表2)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。25 μL PCR擴增反應體系：12.5 μL Taq MIX(EasyTaqTMDNA Polymerase、dNTPs和優化的反應緩沖液反應終濃度為2×，2×EasyTaq PCR SuperMix；全式金AS111-01，北京)；上、下游引物各1 μL；1 μL DNA模板；添加ddH2O至25 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，53 ℃(COⅠ)或者55 ℃(16SrRNA)退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸5 min。

1.6 序列的測定與分析

PCR擴增產物送生工生物工程(上海)股份有限公司成都測序部進行ABI3730XL單向測序，使用PCR檢測時相對應的上游引物進行測序，將測序結果在NCBI中使用Nucleotide collection(nr/nt)數據庫進行BLAST物種比對分析，以相似性程度判斷相應物種DNA非損傷性取樣是否成功。

表2 引物信息Table 2 Primers used in PCR

注： COⅠ-1/COⅠ-2為鈴蟾屬Bombina專一引物， 其余COⅠ引物為通用引物

Notes： COⅠ-1/COⅠ-2 is a specific primer ofBombina， and the rest are universal primers

2 結果

2.1 BLAST比對分析

共獲得11個物種34只個體的46個剪趾、體表、口腔樣本共計46條線粒體基因序列，同一個體不同來源樣本的相同基因序列一致。BLAST比對結果表明，受檢樣本物種基因序列匹配度除疣刺齒蟾Oreolalatrugosus的1個樣本為97%，其余各樣本均在99%以上，部分樣本達100%。每只個體上傳 1條基因序列到GenBank，共計上傳34只個體34條基因序列(附錄Ⅰ)。

2.2 DNA提取方法比較

采用不同的DNA提取方法，剪趾樣本獲得的DNA質量沒有明顯差異，均能獲得目標物種的線粒體DNA序列，擴增測序成功率100%；而擦拭樣本所獲得的DNA質量表現出一定程度的差異，進而影響測序的成功率。

“在翻譯過程中，有時譯者想把源語所承載的各種文化信息轉譯到譯入語中，因此“直譯”是他們的第一選擇。直譯帶有濃厚的源語文化痕跡”（趙德全，2009）。[14]

在對所有樣本使用相同引物(16SrRNA通用引物)的前提下，通過高鹽法提取擦拭樣本(口腔、體表)的DNA質量相對較弱，部分樣本不能獲得物種基因序列，共提取DNA樣本27個，測序成功 21個，成功率為78%。而通過試劑盒提取擦拭樣本的DNA質量良好，共提取DNA樣本12個，測序成功率達100%(表4)。

表3 線粒體序列BLAST比對結果Table 3 BLAST results of the mitochondrial sequence

普雄原鯢Pseudohynobius puxiongensisYXS12-1COⅠ√/—/—P. puxiongensis100山溪鯢Batrachuperus pinchoniiYXS86COⅠ√/—/—Ba. pinchonii99YXS87COⅠ√/—/—Ba. pinchonii99YXS91COⅠ—/—/√Ba. pinchonii99續表3物種Species樣本SampleCOⅠ/16S rRNA體表/口腔/剪趾Skin/mouth/toe匹配物種Matching species in GenBank相似性Identity/%沙坪角蟾Atympanophrys shapingensisYXS11-316S rRNA√/—/—At. shapingensis100YXS71-116S rRNA√/—/—At. shapingensis100YXS77-116S rRNA—/√/—At. shapingensis100棕點湍蛙Amolops loloensisYXS79-1COⅠ√/—/—Am. loloensis100YXS83-1COⅠ√/—/—Am. loloensis100YXS53-4COⅠ—/—/√Am. loloensis100昭覺林蛙Rana chiaoensisYXS60-1COⅠ√/—/—Ra. chaochiaoensis100YXS89COⅠ—/—/√Ra. chaochiaoensis100寶興樹蛙Rhacophorus dugriteiYXS65-116S rRNA√/—/—Rh. dugritei99YXS82-116S rRNA√/—/—Rh. dugritei99

注： YXS65-1中， YXS65為野外采集標本號， -1為該標本所取的剪趾， 或體表擦拭， 或口腔擦拭樣本號； 下同

Note： YXS65 is number of the field collected specimen， -1 is the ID of the specimen from the toe， skin， or mouth； the same below

2.3 不同引物比較

實驗結果表明，剪趾樣本使用4種通用COⅠ引物均可擴增并成功測序。而擦拭樣本在模板全部使用試劑盒提取DNA的前提下，運用6對不同線粒體基因引物進行DNA擴增，不同類群物種明顯受引物特異性的局限，擴增成功率受到明顯影響。COⅠ通用引物VR1d/VF1d僅中華蟾蜍華西亞種Bufogargarizansandrewsi擴增并測序成功；通用引物F/R也僅在棕點湍蛙Amolopsloloensis和昭覺林蛙Ranacliaoensis2個物種中擴增成功。4對COⅠ通用引物均不能在大蹼鈴蟾Bombinamaxima中擴增成功，只有使用鈴蟾屬Bombina專一引物才成功獲得該物種序列。16SrRNA通用引物雖然在角蟾科Megophryidae物種以及樹蛙科Rhacophoridae物種中可以成功擴增，但卻不能擴增鈴蟾科Bombinatoridae物種大蹼鈴蟾(表5)。

3 討論

3.1 DNA體表擦拭取樣的應用

已有的兩棲類體表擦拭取樣的研究比較局限，只在零星的幾個物種中有報道。Mendoza等(2012)從離趾蟾Eleutherodactylusjohnstonei的68只個體中獲取體表涂抹樣本，使用DNeasy提取試劑盒、鹽析、酚-氯仿抽提等方法提取DNA，并通過擴增16SrRNA的線粒體基因比較了提取DNA的質量，證明在該物種中獲取上皮脫落組織是可用的。Pichlmüller等(2013)利用皮膚擦拭取樣在火蠑螈Salamandrasalamandra的幼體中獲得DNA并完成了微衛星分型。

本研究對四川申果莊省級大熊貓保護區內的6科10屬11種兩棲動物隨機就地體表擦拭取樣，這些動物涵蓋有尾及無尾兩棲類多個類群的多個物種，并涉及多種生境類群。通過對PCR產物的測序分析，在所有受檢物種中，研究獲得的COⅠ序列和16SrRNA序列與GenBank中相應物種的序列相似性均在97%以上，絕大部分樣本匹配度達到99%和100%，表明擦拭獲得的DNA均可以擴增獲得目標物種序列。

由此說明，體表擦拭獲取DNA的方法在兩棲動物各類群中可以廣泛應用。

表4 不同方法提取不同物種樣本的結果比較Table 4 Comparison of extracted DNA in different sample of species by different methods

注Note： ×/—/— 測序失敗的體表樣本the skin sample of failing to sequence

表5 不同引物擴增獲得的測序成功率Table 5 The sequencing success rate of PCR amplification using 6 primers

注： 引物Chmf4/Chmr4、COⅠ-CO2/COⅠ-CO4和COⅠ-CO1/COⅠ-CO3混合使用， 即上游引物Chmf4、COⅠ-CO2、COⅠ-CO1混合記作F， 下游引物Chmr4、COⅠ-CO4、COⅠ-CO3混合記作R； √ 該號樣本擴增并測序成功， × 未成功， — 未進行該引物檢測

Notes： Primers Chmf4/Chmr4， COⅠ-CO2/COⅠ-CO4 and COⅠ-CO1/COⅠ-CO3 were mixed and used in PCR， the upstream primers Chmf4， COⅠ-CO2 and COⅠ-CO1 are denoted as F， and the downstream primers Chmr4， COⅠ-CO4， COⅠ-CO3 mixture are denoted as R；√ indicates successful PCR amplification and DNA sequencing， × indicates failed PCR amplification and DNA sequencing， — indicates the detection was not carried out

3.2 DNA提取方法的影響

與剪趾樣本相比，體表擦拭獲得的DNA質量較差。同時，擦拭樣本DNA提取難度更大，不同的DNA提取方法獲得的DNA質量存在一定差異。其中，高鹽法可獲取數量較多的DNA，但所獲DNA純度較低，混有較多脂類、蛋白質等有機物，這些雜質可能影響PCR擴增成功率；而試劑盒提取雖然會造成DNA量的損失，但可獲得純度更高的DNA，PCR擴增成功率更高(邵勁松等，2013；李霞等，2015)。

實驗結果表明，在使用同一對引物P7/P8的前提下，隨機抽取的5個物種以試劑盒提取的DNA擴增測序成功率為100%，高于高鹽法的78%。Mendoza等(2012)的研究中，使用試劑盒和鹽析法提取的DNA均成功地擴增到了16SDNA片段，其中，試劑盒提取的DNA擴增成功率(90%)比高鹽法(80%)的高。

因此，針對體表擦拭樣本，建議使用試劑盒提取DNA。

3.3 引物特異性的影響

與剪趾樣本相比，體表擦拭獲得的DNA量較少，含有較多環境細菌等非目標物種的DNA。因通用性較強的引物對非目標物種DNA也同樣擴增，甚至會產生優勢擴增情況，導致目標物種擴增失敗，因此，體表擦拭樣本在提取DNA時對引物專一性的要求有所增加。

實際上，同類非損傷性取樣研究中，研究者多針對其研究類群，設計專一引物獲得目標物種基因序列。Prunier等(2012)在2種兩棲類物種中用非損傷性取樣的DNA樣本完成了14個微衛星位點的基因分型研究，對每個微衛星位點專門設計了特異性引物。針對離趾蟾完成的非損傷性取樣測序檢測，設計了特異性的16SrRNA引物(Mendozaetal.，2012)。Simon等(1994)在蚓螈目5個種的研究中也使用了特異性的16SrRNA和POMC引物。

體表擦拭取樣獲得的DNA量小且成分相對復雜，因此，建議針對各類群設計特異性強的引物進行擴增測序，以達到良好的目標物種擴增成功率。

致謝：野外數據采集得到四川省申果莊大熊貓自然保護區拉吉保護站、石門保護站和四川省林業廳野生動植物與自然保護區管理處和管理站工作人員的大力支持，謹此深表謝意！

附錄Ⅰ 受檢標本信息(括號中為各標本上傳GenBank的COⅠ或16S rRNA序列號，其中COⅠ序列用下劃線標出)Appendix Ⅰ Specimens examined for COⅠ and 16S rRNA genes (GenBank accession numbers are in parentheses， and COⅠ sequences are underlined)