應用DNA條形碼技術鑒別寄生紫薇絨蚧的跳小蜂

張澤源， 秦耀光， 李樞強*

(1. 中國人民大學附屬中學分校，北京100080；2. 中國科學院動物進化與系統學重點實驗室，中國科學院動物研究所，北京100101)

紫薇絨蚧Acanthococcus(=Eriococcus)lagerstroemiae隸屬于半翅目Hemeptera氈蚧科Eriococcidae，常被稱為紫薇絨粉蚧、石榴氈蚧、石榴絨粉蚧，在我國分布廣泛(趙洋民等，1997；姜年俊，許惠，1998；賀冬英等，2008；趙文娟等，2016)，國外分布于韓國、日本等，是危害石榴PunicagranatumL.和紫薇LagerstroemiaindicaL.的主要害蟲(張欽書，孟慶喜，1990；馬金華，2011)。2004年紫薇絨蚧首次在北美被發現，目前在美國12個州有分布(Merchantetal.，2014；Wangetal.，2016)，被認為是危害紫薇的重要入侵生物(Wangetal.，2016)。隨著農藥應用比重減小，利用寄生蜂防治紫薇絨蚧變得日益重要。

姜年俊和許惠(1998)、焦浩和張玉俊(2011)在紫薇絨蚧防治研究中提到了寄生蜂的作用，但未明確具體的種類。根據徐志宏和黃建(2004)的記載，寄生紫薇絨蚧的跳小蜂有4種：絨蚧闊柄跳小蜂Metaphycus(=Aphycus)eriococci、綿蚧闊柄跳小蜂Metaphycuspulvinariae、絨蚧亞翅跳小蜂Submicroteryseriococci和食絨蚧亞翅跳小蜂Submicroteryseriococcophagus，但是否均寄生紫薇絨蚧需進一步核實。準確鑒定寄生紫薇絨蚧的跳小蜂物種是研究其生物學特性及保護與利用的前提和基礎。但跳小蜂種類多、個體微小(通常為1～2 mm)，利用形態特征鑒定時常常需要制作玻片標本并在顯微鏡下觀察分類特征。另外，隱存種現象在昆蟲中非常普遍(Bickfordetal.，2007)，營寄生生活昆蟲的該現象可能更加突出(Smithetal.，2008)，這導致僅依靠形態特征對跳小蜂進行種類鑒定變得愈加困難，而且容易產生誤差。DNA條形碼技術作為一種輔助物種鑒定的工具(Hebertetal.，2003)，近年來得到了廣泛應用，在昆蟲鑒定方面應用前景廣闊(肖金花等，2004；張合彩，喬格俠，2008；宋南等，2013)。近幾年，該技術在寄生蜂鑒定中同樣表現出很高的應用價值(Zhou MJetal.，2012；Zhou QSetal.，2014)，不但解決了一些近緣種、隱存種等分類學難題，同時也對闡明寄生蜂對寄主的專化性起到了重要作用(Zhangetal.，2011；Chestersetal.，2012；Zhouetal.，2018)。

本研究首先對寄生紫薇絨蚧的跳小蜂種類做了野外調查，獲取了北京、山東、江蘇、江西、湖北、湖南、云南、黑龍江、內蒙古、廣西、寧夏、四川、山西和海南的跳小蜂樣本。針對跳小蜂體型小、外部形態變異程度難以把握等分類中的難題，采用分子生物學方法，利用線粒體COⅠ基因的特異性片段(DNA條形碼)來區分和識別寄生紫薇絨蚧的幾種跳小蜂，為今后紫薇絨蚧寄生蜂的快速鑒定和深入系統研究提供有效數據參考。

1 材料和方法

1.1 樣本的采集、保存和鑒定

本研究中的寄生蜂，除特別指出，均是育自紫薇絨蚧的若蟲或雌成蟲，紫薇絨蚧的采集和飼養方法參考Zhang等(2011)。野外采集帶有紫薇絨蚧的老齡若蟲或成蟲的植物枝條并盡快帶回實驗室觀察。在室內將帶有紫薇絨蚧若蟲或成蟲的枝條剪短，放在塑料杯或者尼龍袋中飼養；每天觀察出蜂情況，發現有羽化的寄生蜂即用毛刷將其收集于塑料管中，用無水乙醇浸泡殺死，-4 ℃存放。在體視鏡下檢視收集到的標本，參考文獻(徐志宏，黃建，2004；Zhang & Huang，2004；Wangetal.，2014)進行初步形態分類并通過專家的復核。每個形態種選取一定的樣本用于分子研究，并對所選樣本拍照，便于后期進一步核對。材料樣本信息見表1。

1.2 基因組總DNA的提取

先用蒸餾水沖洗選取的跳小蜂蟲體，放于濾紙上，晾干后使用試劑盒(Qiagene Tissue DNA Kit)提取各樣品的DNA，過程嚴格按照試劑盒說明書操作。凝膠電泳檢測DNA質量。將合格的DNA樣品放入4 ℃備用，或-20 ℃長期保存。

1.3 PCR擴增

目的線粒體COⅠ基因片段擴增選用的引物對參考Zhang等(2011)。PCR擴增的反應體系：5 μL 10×buffer PCR緩沖液，25 mM MgCl2，5 mM dNTP混合液，0.5 U TaqDNA聚合酶，正反向引物各10 pmol和5 μL DNA模板。PCR擴增反應程序為：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收后的產物送測序公司用ABI3730測序儀雙向測序。

1.4 數據處理

獲得的線粒體COⅠ基因片段與GenBank下載的COⅠ基因序列經Clustal W(Thompsonetal.，1994)比對后用BioEdit 7.0.5(Hall，1999)進一步編輯，使用MEGA4(Tamuraetal.，2007)分析各序列的堿基組成、保守位點、變異位點、轉換與顛換的比值(R)等。選取刷盾跳小蜂Encyrtussp.為外群，采用鄰接法(NJ法)構建基因樹(K2P模型)，并計算種間和種內遺傳距離。另外使用BarcodingR(Zhangetal.，2017)對寄生紫薇絨蚧的跳小蜂以及闊柄跳小蜂屬Metaphycus屬內種間和種內遺傳距離的間隔進行分析評估。

表1 跳小蜂樣品采集信息Table 1 Sampling information of encyrtids

續表1編號Code形態種名Species地點Locality時間Collecting date寄主植物Host plantGenBank登錄號GenBankaccession No.09-010A絨蚧花翅跳小蜂Microterys spE江蘇南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH11939109-010B絨蚧花翅跳小蜂Microterys spE江蘇南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH11939209-010C絨蚧花翅跳小蜂Microterys spE江蘇南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH11939309-010D絨蚧花翅跳小蜂Microterys spE江蘇南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH11939409-010E絨蚧花翅跳小蜂Microterys spE江蘇南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH119395E2-046A絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci北京海淀2012/07/17紫薇Lagerstroemia indicaMH119396E2-046B絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci北京海淀2012/07/17紫薇Lagerstroemia indicaMH11939710-117絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci江蘇南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH11939810-118A絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci江蘇南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH11939910-118B絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci江蘇南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH119400E3-002A絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci云南文山2013/04/22紫薇Lagerstroemia indicaMH119406E3-002B絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci云南文山2013/04/22紫薇Lagerstroemia indicaMH119407E3-002C絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci云南文山2013/04/22紫薇Lagerstroemia indicaMH119408E4-123A絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci湖北黃岡2014/06/22紫薇Lagerstroemia indicaMH119401E4-123B絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci湖北黃岡2014/06/22紫薇Lagerstroemia indicaMH119402E4-123C絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci湖北黃岡2014/06/22紫薇Lagerstroemia indicaMH119403E4-123D絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci湖北黃岡2014/06/22紫薇Lagerstroemia indicaMH119404E4-123E絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci湖北黃岡2014/06/22紫薇Lagerstroemia indicaMH11940511-092水木堅蚧闊柄跳小蜂Metaphycus corni-ae北京海淀2014/06/20糖槭Acer saccharumMH119409E2-030B水木堅蚧闊柄跳小蜂Metaphycus corni-ae黑龍江哈爾濱2012/06/10糖槭Acer saccharumMH119410E2-030C水木堅蚧闊柄跳小蜂Metaphycus corni-ae黑龍江哈爾濱2012/06/10糖槭Acer saccharumMH119411E2-030D水木堅蚧闊柄跳小蜂Metaphycus corni-ae黑龍江哈爾濱2012/06/10糖槭Acer saccharumMH119412E2-030E水木堅蚧闊柄跳小蜂Metaphycus corni-ae黑龍江哈爾濱2012/06/10糖槭Acer saccharumMH119413E1-190A加蒙闊柄跳小蜂Metaphycus garmon內蒙古賀蘭山2010/08/10未知UnknownMH119414E1-190B加蒙闊柄跳小蜂Metaphycus garmon內蒙古賀蘭山2010/08/10未知UnknownMH119415E1-190C加蒙闊柄跳小蜂Metaphycus garmon內蒙古賀蘭山2010/08/10未知UnknownMH119416E1-190D加蒙闊柄跳小蜂Metaphycus garmon內蒙古賀蘭山2010/08/10未知UnknownMH119417E2-122A加蒙闊柄跳小蜂Metaphycus garmon北京昌平2009/04/25未知UnknownMH119418E2-122B加蒙闊柄跳小蜂Metaphycus garmon北京昌平2009/04/25未知UnknownMH119419E2-122C加蒙闊柄跳小蜂Metaphycus garmon北京昌平2009/04/25未知UnknownMH119420E2-122D加蒙闊柄跳小蜂Metaphycus garmon北京昌平2009/04/25未知UnknownMH119421E2-122E加蒙闊柄跳小蜂Metaphycus garmon北京昌平2009/04/25未知UnknownMH119422E2-097杰氏闊柄跳小蜂Metaphycus gerardi云南景洪2012/05/14未知UnknownMH119423E2-189杰氏闊柄跳小蜂Metaphycus gerardi四川攀枝花2009/04/25榕樹Figus sp.MH119424E5-117A杰氏闊柄跳小蜂Metaphycus gerardi廣西宜州2009/04/25假連翹Duranta repensMH119425E5-117C杰氏闊柄跳小蜂Metaphycus gerardi廣西宜州2009/04/25假連翹Duranta repensMH119426E5-117D杰氏闊柄跳小蜂Metaphycus gerardi廣西宜州2009/04/25假連翹Duranta repensMH119427E5-117E杰氏闊柄跳小蜂Metaphycus gerardi廣西宜州2009/04/25假連翹Duranta repensMH11942808-58亮光闊柄跳小蜂Metaphycus nitens山西五臺山2007/07/18未知UnknownMH11942910-007亮光闊柄跳小蜂Metaphycus nitens山西五臺山2009/07/20未知UnknownMH11943010-173A亮光闊柄跳小蜂Metaphycus nitens寧夏銀川2010/07/06未知UnknownMH11943110-173B亮光闊柄跳小蜂Metaphycus nitens寧夏銀川2010/07/06未知UnknownMH11943210-173C亮光闊柄跳小蜂Metaphycus nitens寧夏銀川2010/07/06未知UnknownMH119433E1-222A亮光闊柄跳小蜂Metaphycus nitens內蒙古賀蘭山2010/08/11未知UnknownMH119434E1-222B亮光闊柄跳小蜂Metaphycus nitens內蒙古賀蘭山2010/08/11未知UnknownMH119435E1-222C亮光闊柄跳小蜂Metaphycus nitens內蒙古賀蘭山2010/08/11未知UnknownMH11943607_04刷盾跳小蜂(外群)Encyrtus sp. (outgroup)海南五指山2007/05/15未知 UnknownMH119344

2 結果和分析

外部形態特征分類結果顯示，本次收集的寄生紫薇絨蚧的跳小蜂為絨蚧闊柄跳小蜂、細柄闊柄跳小蜂Metaphycuscylindricus、絨蚧花翅跳小蜂MicroterysspE和絨蚧皂莫跳小蜂Zaommaeriococci。闊柄跳小蜂屬內其他非寄生紫薇絨蚧的種類分別為水木堅蚧闊柄跳小蜂Metaphycuscorniae、加蒙闊柄跳小蜂Metaphycusgarmon、杰氏闊柄跳小蜂Metaphycusgerardi和亮光闊柄跳小蜂Metaphycusnitens。

2.1 COⅠ基因片段序列堿基組成

本研究共獲取了93個跳小蜂樣本的線粒體COⅠ基因片段序列(GenBank登錄號：MH119344～MH119436)，其中，絨蚧闊柄跳小蜂29條、細柄闊柄跳小蜂14條、絨蚧花翅跳小蜂8條、絨蚧皂莫跳小蜂13條、水木堅蚧闊柄跳小蜂5條、加蒙闊柄跳小蜂9條、杰氏闊柄跳小蜂6條、亮光闊柄跳小蜂 8條、刷盾跳小蜂1條。另外，從NCBI數據庫中獲取黃色闊柄跳小蜂Metaphycusflavus序列1條(GenBank登錄號：FM210164)(Pasqueretal.，2009)。截取COⅠ基因序列兩端不可靠的堿基后得到長度為612 bp的堿基矩陣。MEGA4分析結果顯示，在線粒體COⅠ條形碼區域中，A與T的含量非常高(A=28.8%，C=12.4%，G=15.1%，T=43.6%)。GC含量在密碼子第三位點平均為8.7%，明顯低于第一位點和第二位點(平均為34.4%和39.4%)。共檢測到391個保守位點，221個變異位點，R=0.87。

2.2 分子系統樹分析

以刷盾跳小蜂為外群，基于94條跳小蜂線粒體COⅠ基因序列數據矩陣構建NJ樹，結果(圖1)顯示，內群93條跳小蜂COⅠ基因序列聚成9個大的分支，并且除黃色闊柄跳小蜂序列少無法統計支持率外，其他每個分支都有>95%的支持率。這9個分支分別對應9個形態種，其中，闊柄跳小蜂屬為單系群。此外，絨蚧闊柄跳小蜂分成了2個較為明顯的分支，表明該種內部存在較明顯的分化。

2.3 種間和種內的遺傳距離

應用MEGA4計算9種跳小蜂線粒體COⅠ基因序列的種內與種間遺傳距離。結果顯示(表2)，絨蚧闊柄跳小蜂的種內遺傳距離最大，為0～0.054 9，平均為0.026 5；細柄闊柄跳小蜂和絨蚧皂莫跳小蜂的種內平均遺傳距離次之，分別為0.014 7和0.010 4。跳小蜂各種間平均遺傳距離為0.073 2～0.186 4(表3)，其中，絨蚧花翅跳小蜂和絨蚧皂莫跳小蜂的種間平均遺傳距離最大，為0.186 4；細柄闊柄跳小蜂和黃色闊柄跳小蜂的種間平均遺傳距離最小，為0.073 2。對NJ樹上絨蚧闊柄跳小蜂2個較明顯的分支進行遺傳距離分析顯示，它們之間的平均遺傳距離為0.041 8，分支內平均遺傳距離分別為0.018 6(分支1)和0.003 7(分支2)。本研究中 9種跳小蜂線粒體COⅠ基因序列的種內與種間遺傳距離顯示，各跳小蜂的種內遺傳距離與種間遺傳距離間沒有重疊區域，即種間遺傳距離和種內遺傳距離之間有間隔(圖2)。

表2 9種跳小蜂的種內平均遺傳距離Table 2 Intra-species genetic distance of encyrtids

圖1 基于跳小蜂COⅠ基因序列構建的鄰接樹Fig. 1 Neighbour-Joining tree based on the COⅠ sequences of encyrtids

注 Notes： 1. 細柄闊柄跳小蜂Metaphycuscylindricus， 2. 絨蚧闊柄跳小蜂Metaphycuseriococci， 3. 絨蚧花翅跳小蜂MicroterysspE， 4. 絨蚧皂莫跳小蜂Zaommaeriococci， 5. 水木堅蚧闊柄跳小蜂Metaphycuscorniae， 6. 黃色闊柄跳小蜂Metaphycusflavus， 7. 加蒙闊柄跳小蜂Metaphycusgarmon， 8. 杰氏闊柄跳小蜂Metaphycusgerardi， 9. 亮光闊柄跳小蜂Metaphycusnitens

圖2 9種跳小蜂COⅠ基因序列的種內與種間遺傳距離的分布頻率(K2P模型)Fig. 2 Frequency distribution of the intra- and inter-species genetic distances of 9 encyrtid species based on COⅠ sequences (K2P model)

3 討論

本研究利用DNA條形碼技術鑒別了我國9種跳小蜂，其種間遺傳距離遠大于種內遺傳距離，且兩者沒有重疊，表明DNA條形碼技術能區別我國寄生紫薇絨蚧的跳小蜂種類。研究結果顯示，屬間的遺傳距離大于屬內不同種間，并且NJ樹顯示寄生紫薇絨蚧的幾種跳小蜂各聚類成單系群，表明DNA條形碼能夠區分這9種跳小蜂。這與之前關于利用DNA條形碼鑒別跳小蜂種類的研究結論(Zhangetal.，2011；Chestersetal.，2012)一致。

本研究中，闊柄跳小蜂屬的種類屬于同一個種團，親緣關系相近，形態差別很小(Wangetal.，2014)。但是DNA條形碼分析結果顯示，它們之間的遺傳距離遠大于目前DNA條形碼研究中通用的分種標準(遺傳距離>4%)。這表明DNA條形碼技術對同屬的跳小蜂近緣種具有很好的識別效果。另外，DNA條形碼技術也有助于了解物種內的分子變異程度。研究結果顯示，絨蚧闊柄跳小蜂的COⅠ基因序列聚成2個分支，并且2個分支間的平均遺傳距離較大。但是觀察這2個分支上的樣本，其外部形態幾乎沒有差別或差別極小，在地理分布上，這2個分支上的樣本明顯重疊，這種遺傳結構形成的機制或是否存在隱存種需要進一步研究。

跳小蜂種類較多，寄生關系比較復雜，且對于我國跳小蜂種類和寄生關系也缺乏系統深入的調查。本研究使用的跳小蜂種類有限，特別是同屬種類較少，因此，基于COⅠ基因計算跳小蜂的種內和種間遺傳距離是否存在間隔還有待進一步研究。本研究中9種跳小蜂的種內和種間遺傳距離不存在重疊，且進化樹上各形態種形成單系，表明了DNA條形碼技術可以快速、準確地鑒別這幾種寄生紫薇絨蚧跳小蜂。隨著未來其他寄生蜂種類COⅠ基因序列信息的不斷補充與完善，DNA條形碼技術必將對研究我國蚧蟲寄生蜂的物種識別、闡明寄生蜂對寄主的專化性規律和利用寄生蜂開展有效的生物防治產生積極的推動作用。