鵝細小病毒基因組結構研究進展

曹 楠 楊舒展 黃冠雄 郭思璇 曾依翎 李冰心 田允波 許丹寧

（1.仲愷農業工程學院動物科技學院，廣東 廣州 510225；2.廣東省水禽健康養殖重點實驗室，廣東 廣州 510225；3.廣東出入境檢驗檢疫局技術中心，廣東 廣州 510623）

鵝細小病毒（Goose Parvovirus Virus，GPV）可侵染3～20日齡雛鵝和雛番鴨小鵝，造成出血性、纖維素性和滲出性腸炎，是雛鵝和雛番鴨的一種嚴重傳染病［1］。揚州大學的方定一教授于1956年首次發現了GPV并對其做了詳細的研究［2］。此后，日本［3］、英國［4］、匈牙利［5］、瑞典［6］、法國［7］和美國［8］等許多國家陸續報道了該病。與此同時，該病在我國福建［9］、江蘇［10］、四川［11］、山東［12］等主要的水禽養殖地區廣泛流行，給水禽養殖行業造成了嚴重的經濟損失。國內外很多學者都對其展開了研究，經過幾十年的不斷探索，GPV的分子結構及相應的生物學特點逐漸被研究透徹。

1 鵝細小病毒病原學

GPV屬于細小病毒科細小病毒屬，病毒粒子呈圓形或六角形，外直徑為20～25 nm，內直徑約為15 nm，外殼厚約5 nm，可以形成二十面體對稱的空間結構［13］。通過X射線衍射發現，GPV病毒粒子每個5重對稱軸上均含有一個中空圓柱體，并且有溝槽環繞圓柱體的周圍。此外，GPV每個2重對稱軸上有一個凹窩，每個3重對稱軸上有一個突起，這個突起是病毒對宿主嗜性的決定因素［14］。GPV病毒粒子表面沒有囊膜結構，單鏈線狀DNA構成病毒的核酸結構，外部由3種結構蛋白組成病毒的衣殼。感染性GPV顆粒的沉降系數為110 S，而缺少DNA的非感染性GPV粒子則為65 S。GPV對外界環境有著較強抵抗能力，在56℃條件下作用1 h仍然具有活性并可導致鵝胚死亡。由于GPV表面沒有囊膜結構，所以乙醚、氯仿等有機溶劑無法對病毒產生作用，并且GPV對胰酶也有抵抗力，但對紫外線較敏感［15］。大多數種類的細小病毒，如犬細小病毒（Canine Parvovirus Virus，CPV）、貓泛白細胞減少癥病毒（Feline Panleukopenia Virus，FPV）等具有血凝性，然而GPV卻無血凝性［16］。

2 鵝細小病毒分子結構

GPV基因組由單鏈線狀DNA構成，全長為5 kb左右，如圖1所示［17］，GPV基因包括2個開放性閱讀框，可合成5種基因，分別為VP1、VP2、VP3、NS1和NS2，其基因長度分別為2 199、1 764、1 605、1 884 nt和1 356 nt。病毒基因組5′及3′端還具有重復倒置的回文結構（Inverted Terminal Repeat，ITR），其長度為444 nt，分為頭部和“泡區”。GPV的基因組可以編碼5種蛋白，分別為3種結構蛋白VP1、VP2、VP3及2種非結構蛋白NS1、NS2，編碼蛋白質分子質量分別為88、65、60 ku和77、50 ku左右［18-20］。Viginie［21］通過基因序列對比分析發現，鵝細小病毒與番鴨細小病毒同源性較高，這提示這兩種病毒有可能都是從腺聯病毒2型演化而來的。

圖1 GPV基因組結構

2.1 結構蛋白

GPV的LORF可以編碼3種結構蛋白，分別為VP1、VP2、VP3。這3種結構蛋白的起始密碼子位點各不相同，但是共用相同終止密碼子［22］。GPV的VP基因中有一個P41啟動子位于起始密碼子前，P41的轉錄產物經剪接后翻譯產生VP1和VP2蛋白。在合成整個核殼后，GPV的VP2蛋白N端剪去部分氨基酸從而形成VP3［23］。通過序列分析發現，GPV有3個閱讀框，其中VP1基因包括VP2基因，VP2基因又包括VP3基因。VP1和VP3基因的起始密碼子是ATG，但是VP2的起始密碼子是非典型的ACG。這些基因編碼的VP1蛋白比VP2蛋白N末端多145個氨基酸，比VP3蛋白N末端多198個氨基酸［24］。

根據對不同種類細小病毒結構蛋白的研究發現，VP1、VP2、VP3蛋白參與到病毒感染宿主細胞的過程。VP1蛋白在病毒衣殼蛋白的合成及形成感染性顆粒的過程中起著重要作用。VP1蛋白的N末端含有信號肽序列，可以引導病毒在宿主細胞內的定位；其N末端還有一些磷脂酶序列，可能參與了病毒的感染。細小病毒侵入到宿主細胞后，病毒衣殼通過內吞小體轉運至細胞核，VP1蛋白由于低pH值等不良環境暴露出其獨特區，暴露出的N端就可指引內吞小體往細胞核轉運［25］。如果病毒的VP1蛋白缺失，VP2蛋白也可以折疊組裝病毒顆粒，說明VP2參與病毒衣殼的合成以及病毒顆粒的細胞核輸出［26-27］。

構成GPV衣殼蛋白的3種結構蛋白均有抗原性，其中VP3蛋白占的比重最大，約為80%［28］。VP3蛋白為抗原決定簇的主要成分，構成鵝細小病毒的保護性抗原［29-30］。研究發現，VP3以多肽的形式暴露于病毒表面，是GPV重要的免疫保護性抗原，可以誘導動物機體產生中和性抗體，在GPV的免疫防制及診斷中具有重要的意義［31］。

由于GPV是無囊膜病毒，其衣殼蛋白表面的凹痕或突起能夠識別受體［32］。糖脂、聚糖和糖蛋白可以作為受體幫助鵝細小病毒進入宿主病毒［33］，這意味著衣殼蛋白的任何突變或改變都可能導致病毒無法侵入宿主細胞［34］。之前的研究表明，Adeno-associated Virus-2（AAV-2）的 VP蛋白上有5個氨基酸（Arg-484，Arg-487，Lys-532，Arg-585，Arg-588）是受體結合位點［35-36］。因為鵝細小病毒和AAV-2同屬細小病毒，因此，在這些受體結合位點或周邊氨基酸的改變可能會改變鵝細小病毒的毒力［37］。其中在VP蛋白489位點氨基酸的改變可能會導致水禽細小病毒從鵝向鴨進行擴散［33］。

2.2 非結構蛋白

非結構蛋白在細小病毒中有著重要的作用。根據研究發現，細小病毒非結構蛋白功能主要有：①參與細小病毒增殖［38］，即人腺病毒相關病毒2型（AAV-2）的NS78蛋白含有高度保守的基序GPTTGK，具有解旋酶活性和與NTP相結合的能力，GPV的NS1蛋白也可能具有這個功能［39］；②對宿主細胞具有毒性作用，即細小病毒的NS1蛋白可導致宿主細胞發生形態變化乃至甚至發生程序性死亡［40］。

細小病毒的NS2蛋白在病毒復制過程中扮演著重要的角色，從而影響感染性病毒顆粒的產生。研究發現，小鼠細小病毒（Minute Virus of Mice，MVM）NS2蛋白可以與核輸出蛋白CRM1結合，從而使NS2蛋白出宿主細胞核進而產生病毒顆粒，如果NS2基因發生變異就會影響病毒衣殼蛋白的合成，也會導致病毒不可復制或使病毒顆粒產生的時間延后［41］。研究發現，MVM的NS2蛋白的氨基末端為毒性作用的活性區域，可以輔助NS1蛋白對宿主細胞的毒性作用。

此外，已經有研究證明GPV的非結構蛋白具有抗原性。邢明偉［42］通過原核表達的方式將GPV H1分離株的NS2蛋白表達出來，經Western-blot和Dot-ELISA鑒定，表達的NS2蛋白可與特異性抗體產生中和。

細小病毒的非結構蛋白在病毒的復制和對宿主細胞毒性作用中有著重要的作用，但是GPV非結構蛋白的作用與其他種類細小病毒的非結構蛋白是否具有相同或相似功能依然有待進一步研究。

2.3 末端回文結構（ITR）

細小病毒科中不同種類的病毒可以根據其ITR的特點分為A、B兩類：A類細小病毒，如腺關聯病毒2型（Adeno-associated Virus-2，AAV2）、人細小病毒B19（Human Parvovirus B19，B19）的基因組兩端的ITR的序列相同，是末端倒置重復序列；與之相對應的是，B類細小病毒基因組兩端的ITR序列彼此不相關。GPV基因組兩端的ITR倒置重復序列相同，并且其形狀大小與B19相近，說明GPV屬于A類細小病毒［42］。GPV毒株基因組兩端的ITR基因長度約為444 nt，但是不同時間和不同地點分離的GPV的ITR長短各不相同。ITR基因組由于其特殊的分子排布，其頭部可以折疊形成U形雙鏈發夾結構，該發夾結構中包含160～180 nt的無錯配“莖部”與44 nt的“泡區”，形成“箭狀”結構。在“泡區”頭端有一個構成對稱中心的SphⅠ內切酶的酶切位點（GCATGC）。除此之外，還有數量眾多的4～10 nt短核苷酸重復序列存在于GPV的ITR基因序列中［39］。

目前，細小病毒基因組中ITR的功能依然并不是很清晰，但是研究認為ITR在細小病毒的復制和組裝過程中發揮著作用，在細小病毒DNA復制過程中扮演著重要的角色。曹佐武［43］將AAV2基因組一端的ITR去除發現，AAV2缺失了一個ITR后，其感染能力和病毒包裝能力明顯降低，說明ITR在細小病毒AAV2的感染力和病毒包裝能力中發揮著重要的作用。

3 結語

目前，關于GPV的研究不夠深入，大多是針對GPV的序列分析及致病性研究，而針對GPV的序列分析大多局限于其LORF和RORF，對于強弱毒株的差異、受體結合位點、抗原位點、跨宿主位點等方面的研究不夠深入。尤其是隨著水禽養殖量的不斷增加，在保證了有效接種疫苗的情況下，依然有大量的GPV病例發生，這說明GPV毒力株和疫苗株可能已經產生了分子生物學上的差異，而研究人員對這種差異的研究依然較少。GPV的ITR結構被認為可能和病毒毒力有關，低致病力毒株或疫苗株的ITR多較短，但ITR的具體功能還需要進一步的科學驗證。關于ITR功能的進一步研究會為GPV基因工程疫苗的研制提供新的研究方向。

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