一種鎳(Ⅱ)剛性特征氮配位聚合物的結構及其細胞毒性研究

賈志麗, 齊真真, 高恩軍

(沈陽化工大學 應用化學學院 遼寧省無機分子基化學重點實驗室, 遼寧 沈陽 110142)

合成藥物與生命大分子的靶類作用機制是藥物活性評價的手段[1].一般認為 DNA 是藥物的主要靶點.由于 DNA 是一種重要的細胞受體,合成藥物切割 DNA 和調節細胞凋亡在致癌和癌癥治療中都起著重要作用[2-3].過渡金屬配合物可以調節對 DNA 結合和切割能力,Ni(Ⅱ)配合物已經被提出用作潛在的抗癌和抑癌劑[4].在癌癥治療領域,順鉑及其衍生物是使用最廣泛的金屬基藥物.但是有一些缺點,如一般毒性,非特異性靶向和獲得性耐藥.在新興的研究領域,結構的合成方面,如高功能的金屬藥物引起了人們極大的關注.本文合成了 Ni(Ⅱ)與剛性氮配位,配體 1,4-bis(1-imidazoly)benzene(1,4-二咪唑基苯,用 L示之)和 CO2協同配位的混合聚合物,即[Ni(L)2(CO2)]n.應用光譜技術、電泳技術、細胞凋亡手段等研究了聚合物與 DNA 的作用機制和對腫瘤細胞抑制效果,并得出有價值的科學信息.

1 實驗部分

1.1 實驗選材

所有試劑均為A.R級. pBR322質粒DNA和FS-DNA(魚精DNA)購自北京華美生物技術有限公司.HeLa細胞經細胞瘤珠儲存和CO2細胞培養達到測定狀態.元素分析(C,H和N)使用Finnigan EA 1112儀器.Perkin-Elmer LS55熒光分光光度計上測量熒光值.SOPTOP XD-RFL熒光顯微鏡進行成像研究.

1.2 配合物的合成

準確稱取硝酸鎳(0.072 g)和1,4-二咪唑基苯(0.025 g)放入裝有12 mL[V(DMF)∶V(H2O)=1∶2]溶劑的聚四氟乙烯反應釜中,用0.05 mol/L HNO3調節pH值為5.6,室溫條件下反應2 h,空氣中的二氧化碳被氧化.置入呈梯度升溫的150 ℃的烘箱中,恒溫加熱72 h后取出,自然冷卻至室溫.形成淡綠色晶體顆粒.收率:59.8 %.元素分析[理論值(實測值),w/%]:C,37.00(37.01);H,4.18(4.17);N,12.33(12.31).

2 結構分析

通過單晶X-射線衍射掃描,得出該配位聚合物在空間呈八面體結構,如圖1所示.晶體結構中主要的鍵長(λ/nm)如下:Ni(1)—O(1):2.068;Ni(1)—O(2):4.154;Ni(1)—N(1):2.122;Ni(1)—N(3):2.127;主要的鍵角[θ/(°)] 如下:O(1)—Ni(1)—N(3)#3:87.251;O(1)#3—Ni(1)—N(1)#3:92.75;O(1)—Ni(1)—N(3):89.57;N(1)#3—Ni(1)—N(3):92.58;N(1)#3—Ni(1)—N(3)#3:87.42;O(1)—Ni(1)—N(3)#3:90.43.圖2是配位原子之間通過配位鍵相互協調所得一維鏈狀結構圖.圖3是配位聚合物的π-π相互作用結構圖.

圖1 配位聚合物配位結構Fig.1 Coordination polymer monomer structure

圖2 配位聚合物一維鏈狀結構Fig.2 Coordination polymer one-dimensional chain structure

圖3 配位聚合物二維網狀結構Fig.3 Coordinationpolymer two-dimensional network structure

3 細胞毒性研究

3.1 熒光光譜

溴化乙錠(EtBr)是一種常用的 DNA 熒光探針,是共軛芳香環的平面分子,這種共軛分子可以平行地嵌入 DNA 雙鏈的配位堿基對之間,形成堆積.EtBr本身有微弱的熒光,而 DNA分子沒有熒光,當 EtBr 插入 DNA 分子之后,EtBr 分子可以平行地固定在 DNA 分子內部,從而使其分子平面剛性增加,碰撞猝滅減小,熒光顯著增強[5-6]. 在 DNA/EtBr 復合物中,EtBr 發出的熒光比游離 EtBr 發射的熒光強度大10倍[6].當 EtBr 從雙螺旋中游離出來或雙螺旋結構減少時,熒光會明顯下降,所以當有其他分子也能嵌入 DNA 堿基對之間時,將會與 EtBr 競爭 DNA,EtBr 將被從 DNA / EtBr復合物中擠出,而 DNA/EtBr 體系的熒光產生猝滅.因此,EtBr 可作為 DNA 結構的熒光探針[7-9]. 根據經典斯特恩方程[8-9]:I0/I= 1 +Ksqr,其中:I,I0分別代表存在和不存在配位聚合物時的熒光強度；Ksq表示斯特恩猝滅常數,定性描述配位聚合物與 DNA 的作用強弱；r代表配位聚合物與 DNA 的濃度比[9].從圖 4 可以看出配位聚合物對 DNA/EtBr 系統產生了影響.以526 nm 作為激發波長,DNA/EtBr 復合物的熒光發射峰處于 613 nm 處.隨著配合物濃度的增加熒光強度逐漸減弱同時伴隨不同程度的熒光猝滅,此現象表明配合物與DNA發生插入作用.從圖5可以看出配合物的猝滅常數Ksq=0.254,說明配合物與DNA發生了插入作用.

(聚合物)=0 mol·L-1 2.c(聚合物)=0.5×10-6 mol·L-1 3.c(聚合物)=1.0×10-6 mol·L-1 4.c(聚合物)=1.5×10-6 mol·L-1 5.c(聚合物)=2.0×10-6 mol·L-1 6.c(聚合物)=2.5×10-6 mol·L-1 7.c(聚合物)=3.0×10-6 mol·L-1 8.c(聚合物)=3.5×10-6 mol·L-1

圖5 配位聚合物的猝滅常數Fig.5 Quenching constant of coordination polymer

3.2 凝膠電泳

帶電顆粒在電場作用下,向著與其電性相反的電極移動,稱為電泳[6].以瓊脂糖為介質的凝膠電泳是測定金屬配合物對 DNA 發生切割或嵌入、解旋作用的重要實驗方法.通過電泳進行環狀質粒 DNA 切割時,超螺旋形式(Form Ⅰ)將觀察到最快的遷移.如果一條鏈斷裂,則超螺旋帶將產生較慢移動的帶切口的圓形(Form Ⅱ).如果兩條鏈都裂開,將會產生一個線性形式(Form Ⅲ),它們在兩者之間遷移.圖 6 是配位聚合物對 pBR322 質粒 DNA切割效果圖.對于沒有金屬配合物的對照,觀察到少量 DNA 切割(泳道 0).當復合物在1.25 μmol/L 濃度下可以誘導質粒 DNA 明顯的裂解,隨著復合物濃度的增加(泳道 1～3),pBR322 DNA 的 Form Ⅰ 的量逐漸減少,而 Form Ⅱ 逐漸增加,說明配位聚合物對質粒DNA具有一定的切割作用與熒光效果相一致.

圖6 配位聚合物切割質粒pBR322 DNA效果圖Fig.6 Coordination polymer cutting plasmid pBR322 DNA renderings

3.3 配合物對HeLa細胞形態學凋亡研究

細胞凋亡是最常見的基因控制過程,在組織穩態和消除不需要的細胞中發揮重要作用,而不影響正常和未受影響的細胞凋亡[10].細胞凋亡又稱細胞程序性死亡,是指細胞在一定的生理和病理條件下,遵循自身的程序,自己結束其生命的過程[11].細胞凋亡不同于細胞壞死,是程序性死亡過程的一種主要形式,強調的是形態學上的改變[12-14].為了觀察配位聚合物對HeLa 的影響,將 HeLa 細胞在載玻片上生長至體積分數為70 %匯合.聚合物加入到培養基中,在 37 ℃下培養 12 h.用 Annexin V-FITC 和 PI 染色凋亡的和活的 HeLa 細胞,在熒光顯微鏡下觀察圖像,結果如圖 7 所示.由圖7可以看出，癌細胞明顯發生改變.

圖7 配位聚合物對HeLa細胞作用12 h后效果Fig.7 Effect of coordination polymer on HeLa cells for 12 h

4 結 論

(1) 用配體 1,4-bis(1-inidazoly)benzene(L 示之)與金屬鎳鹽反應制得的配位聚合物[Ni(L)2(CO2)2]n呈八面體構型.4 個 1,4-bis(1-inidazoly)benzene 配體中咪唑環上的 N 原子和 CO2上的氧原子與中心原子 Ni 配位,該分子存在穿過 Ni(Ⅱ)的中心對稱,形成規則的八面體結構.

(2) 通過熒光譜圖和凝膠電泳可知配位聚合物[Ni(L)2(CO2)2]n與 DNA 之間以插入作用方式存在,同時對 DNA有切割作用.通過細胞形態學研究,配合物在一定程度上可以引起 HeLa癌細胞程序性死亡.