孕烯醇酮肟衍生物的合成與體外抗癌活性

劉躍金, 趙博文, 于春影

(1.沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院, 遼寧 沈陽 110142;2.江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司, 江蘇 連云港 224200)

1997年劉躍金等對羥基膽烷酸類及羥基膽甾烷類化合物進(jìn)行了小鼠L1210白血病細(xì)胞體外增值抑制實(shí)驗(yàn),表明膽甾-3β,5α,6β-三醇L5(見圖1)和3β,5α,6β-三羥基膽-24-酸甲酯具有較好的抗癌活性,且A/B環(huán)的3β,5α,6β-三醇結(jié)構(gòu)是有效結(jié)構(gòu),17β-側(cè)鏈對活性亦有重要影響[1-2].2001年Ana R等從柳珊瑚plexaurellagrisea中分離出化合物膽甾-3β,5α,6β,7β-四醇,它對A549人肺癌細(xì)胞和HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞有較好的抗癌活性,ED50皆為1 μg·mL-1[3].2002年林永成等從海洋真菌2059(保藏號CCTCCM202030)提取出化合物麥角甾-8(9),22(Z)-二烯-3β,5α,6β,7α-四醇,它對BEL-7402人肝癌細(xì)胞和NCI4460人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞的IC50值分別為8.45和5.03 mg/L[4].劉躍金等于2004年[5]和2007年[6]對羥基膽烷酸類及羥基膽甾烷類化合物進(jìn)行了進(jìn)一步的抗癌活性研究,表明膽甾-3β,5α,6β-三醇和3β,5α,6β-三羥基膽-24-酸甲酯對小鼠肉瘤S180有較好的體內(nèi)抗癌活性.上述報(bào)道進(jìn)一步表明A/B環(huán)的3β,5α,6β-三醇結(jié)構(gòu)是有效的部分.2008年Merlani M I等合成了3α-羥基孕甾-20-肟、雄甾-1,4-二烯-3,20-二肟等,它們對Hela子宮頸癌細(xì)胞顯示出一定的抗癌活性[7].考慮肟結(jié)構(gòu)對17β-側(cè)鏈活性的可能影響,以孕烯醇酮為原料合成具有3β,5α,6β-三羥基的甾體母環(huán),同時(shí)具有17β-肟側(cè)鏈的化合物,以進(jìn)一步考察其對抗癌活性的影響.

圖1 膽甾-3β,5α,6β-三醇結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of cholesta-3β,5α,6β-triol

1 合成路線

以孕烯醇酮L0為原料,在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為88 %的甲酸中用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 %的過氧化氫(H2O2)溶液氧化,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3 %氫氧化鈉甲醇(methanol)溶液中水解得3β,5α,6β-三羥基孕甾-20-酮L1.再分別以L0和L1在乙醇(ethanol)中與鹽酸羥胺經(jīng)親核加成、消除反應(yīng)生成3β-羥基孕甾-5-烯-20-肟L3和3β,5α,6β-三羥基孕甾-20-肟L2.L1在乙酸(acetic acid)中經(jīng)乙酐(acetic anhydride,(Ac)2O)酰化得3β,6β-二乙酰氧基-5α-羥基孕甾-20-酮,合成路線見圖2.

圖2 孕烯醇酮肟衍生物等的合成路線Fig.2 Synthetic routes of derivatives of pregnenolone-oxime and so on

2 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

2.1 原料與儀器

孕烯醇酮,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98 %,成都科恩醫(yī)藥化工實(shí)業(yè)有限公司;BEL-7402人肝癌細(xì)胞株,中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心;RPMI1640培養(yǎng)基,美國Gibco公司;杭州四季青小牛血清,浙江天杭生物科技股份有限公司;膽甾-3β,5α,6β-三醇L5,自制[1];其他試劑,分析純,天津市博迪化工有限公司.

細(xì)胞增殖用二氧化碳培養(yǎng)箱，型號INCO2-108，德國MEMMERT；紅外光譜用紅外分光光度計(jì)，型號IFS-55，瑞士Bruker；核磁共振氫譜用核磁共振儀，型號ARX-300B，瑞士Bruker;細(xì)胞光密度測定用酶標(biāo)儀，型號DNM-9602G，北京普郎.

2.2 3β,5α,6β-三羥基孕甾-20-酮的合成

將孕烯醇酮5.0 g(15.8 mmol)加入到120 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為88 %的甲酸中,沸水浴10 min,冷卻至室溫,加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 %過氧化氫15 mL,28 ℃攪拌6 h.減壓蒸出水和甲酸,向反應(yīng)物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3 %氫氧化鈉甲醇溶液100 mL,回流攪拌4 h,過濾,再將濾液減壓濃縮析出結(jié)晶,得淺黃色固體7.5 g,以氯仿-甲醇(體積比15∶1)為洗脫劑,硅膠柱層析,得白色固體1.2 g,收率21.7 %,mp257～259 ℃.IR(cm-1)(KBr壓片):3 419(O—H),2 936(C—H),1 694(C==O).

2.3 3β,5α,6β-三羥基孕甾-20-肟的合成

將3β,5α,6β-三羥基孕甾-20-酮100 mg(0.285 mmol),加無水乙醇攪拌至完全溶解,加入鹽酸羥胺30.7 mg、無水乙醇鈉36.2 mg,攪拌至完全溶解,置于65 ℃加熱回流8 h,反應(yīng)完畢后,蒸出反應(yīng)溶劑,得淡黃色固體90 mg.以氯仿-甲醇(體積比12∶1)為洗脫劑,硅膠柱層析,得白色固體45.2 mg,收率43.3 %,mp 198.5～200.5 ℃(文獻(xiàn)值[8]198～200 ℃).IR(cm-1)(KBr壓片):3 460(O—H),2 931(C—H),2 871(C—H).1HNMR(DMSO-d6)δ：10.32(1H,s,N-OH),4.43(1H,d,3β-OH),4.19(1H,d,6β-OH),3.83(1H,m,3α-H),3.68(1H,s,5α-OH),1.72(3H,s,21-CH3),1.02(3H,s,19-CH3),0.53(1H,s,18-CH3).

2.4 3β-羥基孕甾-5-烯-20-肟的合成

將孕烯醇酮100 mg(0.316 mmol)加無水乙醇攪拌至完全溶解,加鹽酸羥胺22 mg、無水乙酸鈉26 mg,攪拌至完全溶解,加熱回流7 h;加入大量冰水,室溫?cái)嚢杓s1 h,析出大量白色固體,過濾,干燥,得白色固體91.5 mg.以氯仿-甲醇(體積比60∶1)為洗脫劑,硅膠柱層析,得白色固體74.7 mg,收率71.4 %,mp 217.0～219.0 ℃.IR(cm-1)(KBr壓片):3 464(O—H),2 938(C—H),2 851(C—H).1HNMR(DMSO-d6)δ∶10.36(1H,s,N-OH),5.28(1H,t,6-H),4.62(1H,d,3β-OH),3.30(1H,m,3α-H),1.73(3H,s,21-CH3),0.98(3H,s,19-CH3),0.59(1H,s,18-CH3).

2.5 3β,6β-二乙酰氧基-5α-羥基孕甾-20-酮的合成

將3β,5α,6β-三羥基孕甾-20-酮1.0g(2.3 mmol)加入到10 mL冰乙酸與5 mL乙酸酐組成的混合溶液中,沸水浴4 h,冷卻至室溫,加水稀釋后析出白色晶體,過濾,干燥得白色固體0.85 mg,收率66.4 %,mp 214～216 ℃.IR(cm-1)(KBr壓片):3 433(H—O),2 944(C—H),1 736(C==O),1 688(C==O).

2.6 BEL-7402人肝癌細(xì)胞MTT活細(xì)胞染色法體外增殖抑制實(shí)驗(yàn)

處于對數(shù)增長期BEL-7402人肝癌細(xì)胞經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為25 %的胰酶消化后,用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)懸浮細(xì)胞/mL,每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板各孔內(nèi),置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5 % 的CO2培養(yǎng)箱內(nèi),培養(yǎng)24 h.待細(xì)胞貼壁后,棄培養(yǎng)液,PBS(-)洗兩次.精確稱取樣品,用二甲基亞砜(DMSO)助溶后加PBS(-)稀釋,每組12孔,每孔加入的終質(zhì)量濃度分別為3.125、6.25、12.5、25、50和100 mg·L-1,培養(yǎng)24 h.終止前4 h每孔加5 g/L MTT 20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h.棄培養(yǎng)液,各孔加入DMSO 150 μL,室溫振蕩15 min.用DNM-9602G酶標(biāo)儀在570 nm測定各孔吸光度.各測試孔均值與對照孔均值比較,計(jì)算出各個(gè)樣品的直線回歸方程,求出其半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)值.IC=(1-給藥組細(xì)胞數(shù)/對照組細(xì)胞數(shù))×100 %,結(jié)果見表1.

表1 目標(biāo)化合物對BEL-7402肝癌細(xì)胞的體外IC50Table 1 IC50 of target compounds on BEL-7402 hepatocellular carcinoma cell line in vitro

3 討論與結(jié)論

3β-羥基孕甾-5-烯-20-肟、3β,5α,6β-三羥基孕甾-20-肟和3β,6β-二乙酰氧基-5α-羥基孕甾-20-酮經(jīng)IR和1HNMR確證了結(jié)構(gòu)正確.

BEL-7402人肝癌細(xì)胞體外增殖抑制實(shí)驗(yàn)表明:膽甾-3β,5α,6β-三醇L5的抗癌活性明顯好于3β-羥基孕甾-5-烯-20-肟L3、3β,5α,6β-三羥基孕甾-20-肟L2和3β,6β-二乙酰氧基-5α-羥基孕甾-20-酮L4.也進(jìn)一步說明甾體母核的3β,5α,6β-三醇的3,6-乙酰化后,疏水性增強(qiáng),不利于抗癌活性;而17β-側(cè)鏈的親水性增強(qiáng),同樣不利于抗癌活性,側(cè)鏈縮短也可能是活性減弱的一個(gè)因素,這和文獻(xiàn)[1-2,5]報(bào)道基本一致.