二次回歸正交設計優選阻斷NDMA形成的亞硝化抑制劑

熊鳳嬌，馬儷珍,*，王 洋

（1.天津農學院食品科學與生物工程學院，國家大宗淡水魚加工技術研發分中心，天津市水產品加工及質量安全校企協同創新實驗室，天津 300384；2.天津農學院水產學院 水產生態及養殖重點實驗室，天津 300384）

亞硝酸鹽作為一種重要的添加劑，被廣泛用于肉及肉制品的加工過程中。亞硝酸鹽的添加不僅可以提高肉制品的風味和色澤[1-2]，還能起到抑菌、抗氧化的作用[3-4]。但是亞硝酸鹽能夠為亞硝化反應提供亞硝化劑，亞硝化劑可以與肉制品中存在的二級胺類物質反應生成致癌物N-亞硝胺。N-亞硝胺種類很多，有揮發性亞硝胺（包括N-二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）、N-二乙基亞硝胺、N-亞硝基哌啶、N-亞硝基吡咯烷等）和非揮發性亞硝胺（包括N-亞硝基脯氨酸、N-亞硝基羥脯氨酸），其中NDMA是目前研究表明致癌性最強的一種亞硝胺物質[5]。控制N-亞硝胺的方法主要有以下幾種：找出亞硝酸鹽的替代物；使用亞硝化抑制劑來阻斷N-亞硝胺的形成；分解肉制品中已經生成的N-亞硝胺。至今尚未找到一種可以完全替代亞硝酸鹽的物質，因此對于降低肉制品中N-亞硝胺的方法，目前研究較多的是找出亞硝化抑制劑來阻斷N-亞硝胺的形成或分解產品中已經形成的N-亞硝基類化合物。

食品抗氧化劑是一類可以減緩食品氧化，提高食品貯藏期的食品添加劑。研究發現，多種食品抗氧化劑具有較強的清除亞硝酸鹽和自由基的能力，因此可以作為亞硝化抑制劑阻斷肉制品中N-亞硝胺的形成。VC是一種常見的天然抗氧化劑，可以有效清除肉制品中的亞硝酸鹽[6]；VE是一種脂溶性抗氧化劑，可以延緩油脂氧化，具有一定的清除亞硝酸鹽的能力[7]；除了VC和VE外，一些多酚類物質，例如茶多酚等對亞硝酸鹽也有一定的清除作用[8]。迷迭香作為一種天然抗氧化劑被廣泛用于肉制品的貯藏加工中，其主要通過清除自由基達到抗氧化的效果。將不同抗氧化劑結合使用時，可以有效發揮其協同效應，增強抗氧化效果。梁云[9]模擬了一項體外抗氧化實驗，將VC與VE同時添加至菜油中，結果表明，處理后8 d油脂的過氧化值較單獨使用VC降低26%。此外，VE的存在可以有效提高VC的抗氧化活性及脂溶性自由基的清除能力[10-12]。陳家玉[13]研究發現，將迷迭香和沒食子酸復配使用，其抗氧化效果明顯優于單一抗氧化劑。

二次回歸正交試驗組合設計是正交設計的一種，它可以分析多種試驗因素對試驗結果的影響，也能夠建立多元二次回歸方程，屬更高級的試驗設計技術[14]。有關體外模擬體系亞硝化反應的研究中，學者們多以水相體系作為研究對象[15-16]，但考慮到實際的肉糜體系是含有一定脂肪的乳化體系，因此本研究在含有20%油脂的亞硝化體系中添加不同比例的亞硝化抑制劑（茶多酚、迷迭香、VE、VC），采用四因子二次回歸正交試驗設計，優選阻斷NDMA形成的抑制劑最佳配比，并將根據方程預測到的最佳亞硝化抑制劑應用到魚糜制品（魚豆腐）中進行驗證實驗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍魚糜（帶魚） 青島佰騰國際貿易有限公司；大豆蛋白粉 河南盛之得商貿有限公司；變性淀粉 濟南希諾機械有限公司；谷氨酰胺轉胺酶（transglutaminase，TGase） 四川吉晟生物醫藥有限公司；花生油、食鹽、白砂糖、大蒜、豬背膘、雞小胸、雞皮 天津市紅旗農貿市場。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、NaOH、二甲基鹽酸鹽（DMA·HCl）、乳化劑（PEG 8000）、二氯甲烷（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；VC、VE上海藍季科技發展有限公司；NDMA（色譜純） 美國AccuStandard公司。

1.2 儀器與設備

7890A氣相色譜儀 美國Agilent公司；ST 40R離心機美國Thermo公司；18Basic勻漿機 德國IKA公司；STARTER3100酸度計 美國Ohaus公司；XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋 上海科恒實業發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 體外亞硝化模擬乳化體系的制備

參照Kuniyuki等[17]的方法，采用體外模擬條件及亞硝化反應體系，用25 mmol/L、pH值為6.2的磷酸緩沖鹽配制50 mmol/L NaNO2和25 mmol/L的二級胺鹽酸鹽母液。首先在50 mL離心管中加入一定量的NaNO2和二級胺鹽酸鹽溶液，使二者在體系中的終濃度分別為20、10 mmol/L，然后在體系中加入花生油（20%），再將不同配比的亞硝化抑制劑加入模擬體系中，最后加入0.05%乳化劑（PEG 8000）制備乳化體系，同時做對照實驗，對照組中NDMA底物濃度及油脂添加比例等與實驗組保持一致，但不添加亞硝化抑制劑。將制備的亞硝化體系于70 ℃條件下水浴1 h完成亞硝化反應過程，反應終點即用6 mmol/L的NaOH溶液將反應體系的pH值調至13，以終止亞硝化反應。然后向離心管中加入5 mL二氯甲烷，充分振蕩2 min，離心5 min（4 ℃，10 000×g），吸取下層清亮部分，過0.45 μm有機濾膜后裝入氣相色譜儀的樣品瓶中，待上機測定。

1.3.2 二次回歸正交試驗設計

根據前期的預實驗結果，確定以茶多酚質量濃度（x1，40～80 mg/L）、迷迭香質量濃度（x2，40～80 mg/L）、VE質量濃度（x3，40～80 mg/L）和VC質量濃度（x4，40～80 mg/L）為影響因素，進行二次回歸正交組合試驗。將Z1、Z2、Z3、Z4代入原編碼水平，即由于因素數P=4，二水平試驗次數mc=16，零水平試驗次數m0=3[18]，根據γ2的計算公式可得γ＝1.546。因素水平編碼如表1所示。

表 1 因素水平編碼表Table 1 Code levels and corresponding actual levels of independent variables

1.3.3 驗證實驗

1.3.3.1 體外亞硝化模擬乳化體系中的驗證

按照1.3.1節的方法，將二次回歸正交組合設計得出的最佳配比亞硝化抑制劑添加到體外亞硝化模擬乳化體系中，設置6 組重復實驗進行驗證。

1.3.3.2 魚豆腐中的驗證

魚豆腐的制備：魚豆腐的制作工藝及其各種原料配比參考熊鳳嬌等[19]的方法。在斬拌機中先放入微凍狀態的冷凍帶魚魚糜，慢速斬拌，再加入雞小胸肉高速斬拌均勻，依次加入復合磷酸鹽、食鹽、乳化漿、大蒜瓣、小料、乳化肥膘和變性淀粉，繼續斬拌至肉餡細膩均勻，期間加入碎冰，斬拌全過程以及終點溫度控制在10 ℃以內。將制備好的肉餡平鋪在蒸籠中，蒸15 min成型，將成型后的肉糜冷卻切塊，于油鍋中炸3～4 min（大豆油，油溫130～140 ℃），至魚豆腐表面微黃即可。

將由二次回歸正交組合設計得出的最佳配比亞硝化抑制劑應用到魚豆腐的實際生產中，分析亞硝化抑制劑的加入對魚豆腐中NDMA的抑制效果，同時做對照實驗（魚豆腐對照組除了不加亞硝化抑制劑外，其余的原料添加比例與實驗組保持一致），進一步驗證組合設計的試驗結果。

1.3.4 NDMA的測定

參照GB/T 5009.26—2016《食品安全國家標準 食品中N-亞硝胺化合物的測定》[20]，使用氣相色譜儀測定魚豆腐中的N-亞硝胺。

將前處理好的樣品瓶上氣相色譜儀測定，測定條件：進樣口溫度250 ℃；檢測器溫度330 ℃；載氣流速6 mL/min；空氣流速60 mL/min；H2流速3 mL/min；分流模式：不分流進樣；進樣量1 μL。利用安捷倫工作站對色譜圖進行分析及數據處理，采用保留時間進行定性，外標法定量。

1.3.5 NDMA抑制率的計算

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2016軟件進行數據的基本運算，使用Origin 9.0軟件作圖。實驗均重復3 次。

2 結果與分析

2.1 二次回歸正交試驗

2.1.1 二次回歸正交試驗設計結果

二次回歸正交試驗設計結果如表2所示。

表 2 二次回歸正交組合設計正交表及結果Table 2 Quadratic orthogonal regression design with response variable

2.1.2 回歸模型的建立與檢驗

2.1.2.1 擬合度檢驗

總平方和SST=584.269，其中fT=n－1=26，回歸平方和U=474.739，fU=11，剩余平方和Qe2=SSTU=1 0 9.5 3 0，fe2=1 5，均方說明此回歸方程的擬合度檢驗達到顯著水平。

2.1.2.2 偏回歸系數檢驗

表 3 回歸方程與偏回歸系數的顯著性檢驗Table 3 Significance test of the regression equation and partial regression coefficients

由表3可知，偏回歸系數b1、b2、b1’、b2’、b3’、b4’達到顯著或極顯著水平，雖然b12在0.05水平上不顯著，但在0.25水平上是顯著的，故不予剔除。在剔除不顯著項后，簡化的回歸方程為：

y＝38.814－1.342Z1－1.417Z2+0.969Z1Z2－2.348Z1’－2.690Z2’－2.035Z3’－3.700Z4’ （1）

將方程（1）轉化為用自然變量表示的回歸方程：

2.1.2.3 回歸方程的失擬性檢驗

誤差平方和Qe由零水平試驗結果Y01、Y02及Y03獲得：Qe=3.046，fe=3－1=2，擬合度檢驗為：失擬檢驗差異不顯著，說明該方程擬合的很好。

試驗結果表明擬和檢驗差異顯著，失擬檢驗差異不顯著。擬合檢驗差異顯著，說明此回歸模型所考慮因素足以反映試驗中亞硝化抑制劑的添加對NDMA抑制率有影響，失擬檢驗差異不顯著，說明此回歸方程在此試驗中有一定意義。由于數據進行了中心標準化，消除了量綱上的差異，可以直接從回歸系數絕對值的大小來分析各亞硝化抑制劑對NDMA抑制效果的影響。

由回歸方程（1）可知，各回歸系數絕對值的大小依次為b2＞b1＞b3＞b4，說明迷迭香和茶多酚對NDMA的抑制效果較好。邢必亮[21]研究茶多酚的添加對腌肉中NDMA殘留量的影響，結果表明，一定濃度茶多酚的添加可以有效降低腌制肉制品中NDMA的含量，與本研究結果一致。茶多酚抑制NDMA形成的原因可能是茶多酚可以與硝酸發生反應，生成硝基化合物[22-24]。在本研究的模擬體系中，作為反應底物之一的亞硝酸鹽可以在酸性條件下經過系列反應生成硝酸，硝酸可以進一步分解成氮氧化物亞硝化二級胺類物質，生成N-亞硝胺。因此茶多酚可能通過消耗NDMA的前體物質硝酸從而達到抑制NDMA的效果。

由表3可知，對各偏回歸系數進行F檢驗，偏回歸系數Z1、Z2、Z1’、Z2’、Z3’、Z4’對應的P值小于0.05，因此因素x1、x2、x11、x22、x33、x44對試驗指標有顯著影響。

2.1.3 單因素效應分析

在單因素效應分析中，將得到的回歸方程（1）的4 個因素中任意3 個固定在零水平，分別描述單個因素的變動對模擬體系中NDMA抑制率的影響[25-27]。茶多酚、迷迭香、VE、VC 4 個因素的單因素效應方程如下：Y1=38.814－1.343Z1－2.348Z12、Y2=38.814－1.417Z2－2.690Z2

2、Y3=38.814－0.707Z3－2.035Z32、Y4=38.814－0.637Z4－3.700Z42。

把4 個因素的取值固定在－1.546、－1、0、1、1.546水平，根據上述方程，計算出各因素在5 個不同水平上對NDMA的抑制率，并以此作圖。

圖1 各單因素與NDMA抑制率的關系Fig. 1 Relationship between each factors and inhibition rate of NDMA

由圖1可知，各因子處于－1.546～1.546這一水平區間時，4 個影響因素與NDMA抑制率的關系曲線呈拋物線狀，表明這4 個因素不能無限制的升高，超過一定范圍便會使NDMA的抑制率降低。茶多酚（x1）、迷迭香（x2）、VE（x3）和VC（x4）4 種亞硝化抑制劑在－1.546≤Z≤0編碼范圍內時，NDMA抑制率隨著編碼值的增加而增加；而在0≤Z≤1.546編碼范圍內，編碼值與NDMA抑制率呈負相關，模擬體系中NDMA抑制率隨著編碼值的增加呈下降趨勢；4 種因素均在編碼值為0時NDMA抑制率有最大值。

2.1.4 因素間交互效應分析

由表3可知，對回歸方程偏回歸系數進行顯著性檢驗，b12在α=0.25水平上有顯著性差異，表示x1（茶多酚）與x2（迷迭香）之間存在交互作用，但交互作用不顯著（P＜0.05），其他因素之間的交互作用均不顯著。

2.1.5 邊際效應分析

將單因子效應方程本身求一階偏導數，得到單因子的邊際效應方程：dY/dx1=－1.343－4.696Z1、dY/dx2=－1.417－5.380Z2、dY/dx3=－0.707－4.070Z3、dY/dx4=－0.637－7.400Z4。

單因素邊際效應方程反映了Y值隨單個因素水平變化而變化的速率。利用邊際效應方程繪制邊際效應圖。

圖2 邊際效應值分析Fig. 2 Boundry effect curve of each factor

由圖2可知：4 種因素在－1.546≤Z＜0（40≤x＜60）編碼值范圍內，Y值隨著編碼值的增加有上升的趨勢，與編碼值呈現正相關，且上升的速率隨著編碼水平的增加有所下降；在0＜Z≤1.546（60≤x＜80）編碼范圍內，4 種因素的Y值隨著編碼值的增加呈現下降的趨勢，而且下降的速率隨著編碼水平的增加逐漸增加[28-30]。

2.2 優化試驗結果

利用數學求極值的方法，對回歸方程（1）求一階偏導數，用Excel解方程組得，當Z1=0.010 558、Z2=0.008 478、Z3=0、Z4=0時，Y有極大值，各因素x1=60.14、x2=60.11、x3=60.00、x4=60.00，即茶多酚、迷迭香、VE和VC的添加量分別為60.14、60.11、60.00、60.00 mg/L時，可以得到理論上最高的NDMA抑制率。在此亞硝化抑制劑的添加量下，由回歸方程計算出的NDMA抑制率預測值為47.16%。

2.3 驗證實驗結果

在模擬體系中添加茶多酚、迷迭香、VE和VC，添加量分別為60.14、60.11、60.00、60.00 mg/L，結果表明，抑制劑的添加可以抑制模擬體系中45.32%的NDMA；同時將相同水平的亞硝化抑制劑添加到魚豆腐的實際生產中，分析亞硝化抑制劑對魚豆腐中NDMA抑制率的影響，結果表明，亞硝化抑制劑的添加可以明顯抑制魚豆腐中NDMA的形成，NDMA抑制率可達44.00%（對照組中NDMA含量為6.75 μg/kg，實驗組中NDMA含量為3.78 μg/kg），說明本研究所得到的模型與實際擬合程度較好，通過正交試驗所確定的最佳亞硝化抑制劑配比合理可行。

3 結 論

采用四因素二次回歸正交組合方法，建立NDMA抑制率與茶多酚、迷迭香、VE、VC配比的二次回歸方程，根據方程得到4 種抑制劑的最佳配比。結果表明：當茶多酚、迷迭香、VE和VC的添加量分別為60.14、60.11、60.00、60.00 mg/L時，可以得到理論上最高的NDMA抑制率47.16%；將此水平的抑制劑分別加入到模擬體系以及魚糜制品（魚豆腐）中，得出NDMA的抑制率分別為45.32%和44.00%，說明得到的回歸模型與實際擬合效果較好；且由NDMA回歸模型分析可得，茶多酚和迷迭香對NDMA抑制率的影響較顯著。此回歸模型為肉制品加工中N-亞硝胺抑制劑的開發提供了基礎依據，為降低肉制品加工過程中N-亞硝胺的形成提供技術支撐，為實際生產提供了技術支持。