復方倍他米松注射液對小鼠B16 黑素瘤細胞增殖及黑素生成的影響

李 敏,周明偉,劉翔宇,孫銘徽,賈玉璽*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 皮膚科，吉林 長春130033；2.北京大學醫學部)

白癜風是一種常見的色素脫失性皮膚病，發病率約為4%，致病因素可能與下列因素有關：黑素細胞自毀、氧化應激、自由基、免疫發病學說、細胞因子、微量元素等。研究表明，8-MOP對B16細胞有一定的增殖作用[1]，糖皮質激素是治療白癜風的有效藥物之一，酪氨酸酶是黑素合成限速酶，其活性與黑素合成呈正相關[2]。本實驗采用小鼠B16黑素瘤細胞為模型，通過酶學細胞實驗篩選復方倍他米松注射液對小鼠B16細胞增殖、酪氨酸酶活性以及黑素生成的影響，探討其治療白癜風的作用機制。

1 材料和方法

1.1材料

小鼠B16黑素瘤細胞株(中國科學院軍事研究所提供)。胎牛血清及RPMI1640(Gibco)；二甲基亞砜(DMSO)、聚乙二醇辛基苯基醚、L-多巴為Sigma公司產品；CCK-8試劑(東洋紡織)。復方倍他米松注射液(國藥準字J20140160,進口藥品注冊證號、批號H201301888、 6BBKADAC03)。甲氧沙林(8-MOP)，重慶華邦制藥股份有限公司生產(國藥準字H50021757)。倒置生物顯微鏡(LaiKa公司)；全自動酶標儀(Epoch BioTek)、二氧化碳培養箱(三洋)。

1.2方法

1.2.1小鼠B16黑素瘤細胞培養[3]1640培養基傳代，置于含5%CO2飽和濕度，溫度為37℃培養箱中進行培養，用胰蛋白酶(體積分數0.25%)消化生長至融合狀態的細胞，每3天傳代1次，每瓶約105個細胞傳代至25 cm2。

1.2.2細胞增殖活性測定 取100 μl消化好的對數生長期細胞液(5×104個/ML)，接種于96孔板，37℃、5% CO2條件培養24 h，設定復方倍他米松低、中、高劑量組(培養基+復方陪他米松),最終工作濃度為10、20、40 μmol/L；甲氧沙林低、中、高劑量組(培養基+甲氧沙林)，甲氧沙林最終工作濃度分別為10、50、100 μmol/L；細胞陰性對照組(培養基)。向培養板每孔加入 10 μl不同濃度的待測物質，孵育48 h，向每孔加入 10 μl CCK-8 溶液，孵育2 h，每組設3個復孔，置酶標儀450 nm波長測吸光度值，實驗平行重復3次，取均值。

1.2.3黑素含量測定(氫氧化鈉裂解法) 細胞接種方法同上，預先用不同濃度復方倍他米松注射液、甲氧沙林培養細胞72 h后棄上清液，用磷酸鹽緩沖液沖洗2次，加入氫氧化鈉(100 μmol·L-1)，37℃水浴1 h，每組設3個復孔，置酶標儀450 nm波長處測定吸光度值，用所測的吸光度值表示黑素生成量,實驗平行重復3次，取均值。

1.2.4酪氨酸酶活性的測定[4]細胞接種方法同上，不同藥物作用72 h后棄上清液，磷酸鹽緩沖液反復沖洗2次，每孔加入100 μl體積分數1%聚乙二醇辛基苯基醚，震蕩5 min ，置于-20℃1 h ，隨室溫融化，細胞完全裂解，每孔加入100 μl磷酸鹽緩沖液配制體積分數為0.1% L-多巴液，37℃，含5% CO2培養箱孵育2 h，每組設3個復孔，酶標儀490 nm波長處測定吸光度值，用所測吸光度值表示酪氨酸酶的活性，實驗平行重復3次，取均值。

2 結果

2.1小鼠B16黑素瘤細胞增殖活性測定

與對照組相比，各濃度復方倍他米松注射液及中、高濃度甲氧沙林在促進細胞增殖方面作用的差異有統計學意義(P<0.05)，各濃度復方倍他米松注射液與甲氧沙林相比，促進細胞增殖方面作用的差異有統計學意義(P<0.05)，復方倍他米松注在高濃度有顯著促進細胞增殖作用，結果見表1。

表1 復方倍他米松注射液對小鼠B16黑素瘤細胞增殖活性的影響

注：與對照組比較aP<0.05,與甲氧沙林組比較bP<0.05

2.2黑素生成含量測定

與對照組相比，各濃度復方倍他米松注射液及甲氧沙林在促進細胞黑素生成作用的差異有統計學意義(P<0.05)，各濃度復方倍他米松注射液與甲氧沙林促進細胞黑素生成作用的差異有統計學意義(P<0.05)，隨著復方倍他米松注射液濃度的增大黑素合成逐漸增加，結果見表2。

表2 復方倍他米松注射液對小鼠B16黑素瘤細胞黑素生成量的影響

注：與對照組比較aP<0.05,與甲氧沙林組比較bP<0.05

2.3酪氨酸酶活性測定

與對照組相比，各濃度復方倍他米松注射液及甲氧沙林在促進酪氨酸酶活性作用的差異有統計學意義(P<0.05)，中、高濃度復方倍他米松注射液與甲氧沙林相比，在促進酪氨酸酶活性作用的差異有統計學意義(P<0.05)，隨著復方倍他米松注射液濃度的增大酪氨酸酶活性逐漸增加，結果見表3。

表3 復方倍他米松注射液對小鼠B16 黑素瘤細胞酪氨酸酶活性的影響

注：與對照組比較aP<0.05,與甲氧沙林組比較bP<0.05

3 討論

白癜風易診斷難治療，目前治療方案主要分為外用藥物治療，如糖皮質激素、鈣調磷酸酶抑制劑；光療法，如NB-UVB，308準分子激光；手術治療，如皮膚碎片移植、負壓吸皰表皮移植及聯合治療，但尚無可維持長期療效的治療方案[5]。

本實驗探討了復方倍他米松注射液對酪氨酸酶、黑素瘤細胞增殖、黑素生成的影響，酪氨酸酶是黑素合成的關鍵限速酶[6]。目前，酪氨酸酶的活性成為研究白癜風等色素障礙性疾病的靶點。結果顯示：對照組比較，不同濃度組復方倍他米松注射液可對小鼠B16黑素瘤細胞的增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性均有明顯的促進作用，其中高濃度效果明顯，且各指標具有一致性。酪氨酸酶活性增加，可促進黑素合成，從而可能提高白癜風的治療效果[2]。糖皮質激素治療白癜風機制可能是一個雙向的過程：首先，糖皮質激素可抑制免疫系統異常導致的黑素細胞損傷，從而刺激黑素細胞再生，同時可以刺激黑素細胞的生物合成進而刺激黑素細胞再生[7]。本試驗為復方倍他米松注射液治療色素脫失性疾病奠定了理論依據。