孕早期自然流產(chǎn)絨毛中microRNA-17表達水平研究

李 源,張為遠,阮 焱*,舒 暢

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院，北京100026;中國科學院基因組科學與信息重點實驗室)

自然流產(chǎn)是指妊娠不滿 28 周、胎兒體重不足1 000 g，妊娠自行終止者。妊娠 12 周之內(nèi)終止的稱為早期流產(chǎn)。自然流產(chǎn)的發(fā)生率為15%-40%，而其中 80%以上為發(fā)生在 12 周之內(nèi)的早期流產(chǎn)[1]。但是，至今為止，導致早期流產(chǎn)的非細胞遺傳因素及其相關機制仍不完全清楚。有研究認為，早期妊娠終止與滋養(yǎng)層細胞生長不良及其侵襲性受損相關[2]。因此，早期妊娠終止可能與晚期妊娠并發(fā)癥如子癇前期和胎兒生長受限的胎盤缺陷機制相似[3]。此外，還有研究證實，子癇前期胎盤缺陷早于妊娠11周[4,5]。

微小RNA (microRNA，miRNA) 是進化上高度保守的長約22個核苷酸的小型非編碼RNA，通過靶向特異性信使RNA (mRNA) 調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達[6]。它們在細胞生物學的許多方面起著至關重要的作用，包括參與代謝，凋亡和分化等等。近年來，有關microRNA的研究不斷深入且獲得了巨大而廣泛的發(fā)展。研究以確定內(nèi)源性microRNA的靶點及其作用機制。最近，已經(jīng)有研究探討不同病理狀態(tài)胎盤中的miRNA的表達模式。然而，這些研究主要側重于特定的胎盤miRNA，如19號染色體miRNA簇(C19MC)和14號染色體miRNA簇(C14MC)[7,8]。

由于人類滋養(yǎng)層細胞在前3個月與腫瘤細胞在體外具有相似的固有的侵襲特性[9]，因此我們推測，已報道的在腫瘤浸潤過程必不可少的某些miRNA在滋養(yǎng)層細胞植入和胎盤分化過程中也可能具有未被發(fā)現(xiàn)的功能。 miRNA-17-92簇是人類癌癥中表達最廣泛的一種，其中包括B細胞淋巴瘤[10]，肺癌[11]和結腸癌[12]。事實上，miRNA-17-92可促進細胞周期進程、細胞增殖、細胞侵襲和遷移[13]。該簇是位于染色體13q31上的多順反子miRNA基因。它包含6種不同的miRNA， 即-17、-18a、-19a、-20a、-19b和-92；但其中一些具有相同的種子序列[13]。 MiRNA-17和-19被認為是該簇內(nèi)的主要成分，據(jù)報道，它們對腫瘤細胞的入侵和遷移起著至關重要的作用[14]。

在miRNA-17和-19b的許多預測基因靶點中，PTEN(在10號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物)是最常被報道的[15]。 PTEN是常見的腫瘤抑制基因，在人類癌癥和轉(zhuǎn)移腫瘤中其表達水平通常下調(diào)[16]。 PTEN通過拮抗磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)在廣泛的細胞過程(包括細胞生長，增殖和細胞遷移)中起多重作用[16]。 miRNA-17的其他不同靶標包括CREB-1(CAMP反應性元件結合蛋白1)和TGF-β RII (轉(zhuǎn)化生長因子，β受體II)[17]。此外，已經(jīng)表明miRNA-17可通過抑制TGF β1信號通路促進血管生成和腫瘤生長[18]。

因此，本課題旨在確定miRNA-17-92簇的主要成員(即miRNA-17)是否在妊娠早期的胎盤中表達，同時明確其在懷孕早期流產(chǎn)孕婦胎盤絨毛組織中的表達水平。

1 材料和方法

1.1研究對象

本研究的全部參加者均在2014年1月1日至2016年12月31日期間就診于首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院計劃生育門診，研究對象均為懷孕早期(7-9周)的孕婦。本項目經(jīng)我院倫理委員會批準，每位患者均知情同意參加本課題研究，并于研究開始之前簽署書面知情同意書。由于非醫(yī)療原因要求終止妊娠的30孕婦作為對照組，由于早期妊娠終止而接受清宮手術的28例孕婦作為實驗組。參與本研究的孕婦中均無免疫性疾病、慢性病及吸煙史。

1.2絨毛組織

在人工流產(chǎn)手術后立即獲得絨毛組織樣品，置于RNAlater溶液(RNA穩(wěn)定劑，Qiagen，Hiden，Germany)中以保持穩(wěn)定避免RNA降解。然后，在4℃下儲存直至第二天，使用高分辨率立體顯微鏡去除蛻膜和殘余血管，隨之將樣品在-80℃下保存直至進一步實驗分析。

1.3RNA和microRNA分離提取

根據(jù)生產(chǎn)廠商說明書，使用QIAzol1 Lysis Reagent (Qiagen)和miRNeasy Mini Kit (Qiagen)，從5mg絨毛組織中提取總RNA，包括microRNA。在14 ml無RNase的水中，從旋轉(zhuǎn)柱膜上洗脫RNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度計(NanoDrop Technologies /Thermo Scientific)通過260和280 nm處的吸光度測量來評估RNA純度。所有樣品的A260 / A280比值大于1.90，證實了純度高。

1.4反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR(RT-PCR)

此后，根據(jù)生產(chǎn)廠商說明書，使用miScript II RT試劑盒(Qiagen)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，總反應體積為20 μl。在總反應混合物中使用2 μl cDNA進行靶基因的PCR測定。運用7900HT實時快速PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)進行檢測。 miScript SYBR Green PCR試劑盒(Qiagen)用于測定miRNA 17-92：miRNA-17(引物Hs_miR_17_2，目錄號MS00029274)。使用snRNA U6(引物Hs_RNU6B_2_1，目錄號MS00029274)作為內(nèi)參對照。使用25ul總反應體積中的2 μl cDNA進行miRNA的PCR測定。

1.5數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析

使用REST(relative expression software tool，相對表達式軟件工具)分析數(shù)據(jù)，其中使用的數(shù)學模型基于樣本和對照組之間的平均閾值周期(CT)差異。該軟件通過隨機測試與成對重新分配來評估對照和病例樣本之間的表達差異的統(tǒng)計學顯著性。這種統(tǒng)計方法的優(yōu)點是沒有采用正態(tài)性假設，而且與傳統(tǒng)參數(shù)測試一樣強大[19]。Fisher精確檢驗用于比較分類變量。采用數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件SPSS 18.0(SPSS Inc.，Chicago，IL)用于數(shù)據(jù)分析。P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

兩組患者的主要臨床特征之間未見顯著統(tǒng)計學差異(表1)。來自早期妊娠流產(chǎn)的絨毛組織中miRNA-17的表達水平較對照組下降了兩倍以上(相對表達分別為0.35)(圖1)。由于我們發(fā)現(xiàn)miRNA的表達水平與胎齡無相關性，因此無需對胎齡進行任何調(diào)整。

表1 研究對象的臨床特征

注：數(shù)據(jù)以n(%)、平均值或四分位范圍(IQR，interquartile range)的形式表示。統(tǒng)計方法使用Mann-Whitney U檢驗或Fisher精確檢驗。

圖1 絨毛組織中miRNA-17表達水平的組間差異

來自早期妊娠流產(chǎn)(1.505±0.580)的絨毛組織中miRNA-17的表達水平較對照組(4.349±0.104)下降了兩倍以上(相對表達為0.35；P<0.001)。

3 討論

本課題研究了早期懷孕期間miRNA-17在胎盤的表達水平，我們的實驗結果證實：miRNA-17在自發(fā)流產(chǎn)病例的絨毛組織中的表達水平呈顯著下降。本研究表明，miRNA-17可能參與早期人類胎盤形成。

由于人類胎盤在妊娠前期是一種具有高度侵襲性和增殖性的結構，所以一般認為自發(fā)流產(chǎn)是早期胎盤缺陷所致。 而且，這與其他妊娠并發(fā)癥的病理生理機制具有共同的特點，如自發(fā)早產(chǎn)，先兆子癇和胎兒生長限制[3,20]。

成長過程中的胎盤和腫瘤都具有早期侵襲能力，這樣才能允許他們建立最佳的血液和營養(yǎng)供應來保持持續(xù)增長的狀態(tài)和能力[21]。因此，它們之間可能具有類似的機制，從而可以在人類組織的侵襲和擴散中獲得成功。本研究證實，與正常妊娠相比早期自然流產(chǎn)中miRNA-17是人類癌癥中最常擴增的microRNA之一，通常被稱為“oncomiR”，明顯下調(diào)。這反之表明這種miRNA可能在早期胎盤形成及其發(fā)生和發(fā)展過程中起著關鍵作用。

盡管廣泛的研究致力于了解miRNA-17-92簇在致癌基因中的作用，但是該簇在正常組織中的生理作用尚不清楚。在小鼠進行的實驗研究中已經(jīng)提示，miRNA-17-92簇的缺陷表達與產(chǎn)后存活不相符[22]。此外，在實驗研究中，miRNA-17-92的高表達已經(jīng)在多種組織的早期發(fā)育階段被報道[23]。這促使我們設計這項研究，以確定該群體的成員是否在人胎盤早期階段表達，并明確其在人類妊娠過程中所發(fā)揮的相關作用。

本課題屬于初步探索性質(zhì)，盡管樣本量較小，但是本研究仍然提供了對人類早期胎盤形成的一些關鍵相關機制的線索，提示miRNA-17對于人早期胎盤形成是至關重要的。本研究的一個可能的限制是沒有流產(chǎn)病例的具體相關原因的數(shù)據(jù)。但據(jù)既往研究報道認為，無論是什么原因，流產(chǎn)的滋養(yǎng)層絨毛組織樣本都適合于早期胎盤研究，因為它們都提示滋養(yǎng)層功能障礙[24]。

總之，我們提供了miRNA 17這一主要代表的胎盤表達數(shù)據(jù)，其屬于人類中最高度保守的miRNA簇之一，本研究數(shù)據(jù)明確提示其可能參與早期胎盤形成。進一步研究探索這種miRNA簇在胎盤相關疾病如先兆子癇和胎兒生長受限中的作用，及其細胞生物學功能和調(diào)控的靶基因是非常必要的。