冀谷34中自噬相關基因SiATG5的克隆及響應干旱脅迫機理研究

王根平，劉敏軒，2，張 婷，師志剛，張喜瑞，楊偉紅，李 琳，高 翔，董 立，程汝宏*

（1.河北省農林科學院谷子研究所，國家谷子改良中心，河北省雜糧研究實驗室，河北 石家莊 050035；2.中國農業科學院作物科學研究所，國家農作物基因資源與基因改良重大科學工程，北京 100081）

自噬是真核生物在生長過程中抵御各種環境脅迫時細胞內一種進化保守的物質代謝降解過程。在逆境脅迫下，細胞通過自噬將胞內多余的蛋白質或受損細胞器進行降解并加以循環利用，從而維持細胞穩定和應答環境脅迫[1，2]。細胞自噬形式主要有巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬3種[3]。在植物中研究最多的是巨自噬[4]。巨自噬首先包被降解物于雙層膜結構的自噬小體（Autophagosome）中，通過自噬小體外膜與液泡膜的融合將包裹物質送入液泡腔并完成降解，從而應對饑餓或逆境脅迫下營養物質的不足[3]。

自噬需要自噬相關基因（Autophagy-related genes，ATG）編碼蛋白的參與。ATG最先在酵母中發現[5]，得益于酵母上的工作，目前在擬南芥[6，7]、煙草[8]、水稻[9]、玉米[10]和谷子[11]等植物中也發現了ATG同源基因。不同植物中已報道的ATG數量有30個左右，分布于基因組的不同位置。ATG蛋白參與細胞代謝和生長發育的多個進程，如細胞程序性死亡、衰老、營養缺乏、液泡形成、逆境脅迫等[5-7]。在正常條件下，ATG處于低水平表達；在逆境脅迫，如饑餓、干旱、高鹽、氧化脅迫、病毒侵染等誘導下，其表達量升高[12]。如，谷子ATG8響應低氮誘導，在氮源匱乏的條件下表達量升高[11，13]；煙草ATG6同源基因BECLIN1可以促使病毒感染位點細胞的死亡，從而阻止病毒向未侵染部分擴張[14]；水稻OsATG7-1突變體植株出現生物量和氮利用率降低的缺陷；玉米ATG12突變體植株出現葉片衰老加速和穗發育畸形的表型[10]。

研究表明，ATG5在自噬體形成和逆境脅迫中起著重要作用。Romain等發現，擬南芥ATG5蛋白是自噬體形成的關鍵蛋白，在ATG5突變體植株中不能形成自噬體[15]；另外，擬南芥ATG5突變體植株在低氮和避光條件下出現葉片失綠變黃、葉斑增加、葉片衰老加速等表型特征，而ATG5正常植株可以存活較長時間[16，17]。然而，有關ATG5對干旱響應的作用機理研究報道較少。因此，研究ATG5在干旱脅迫下的表達模式，對闡釋ATG5在抗旱中的功能作用具有重要意義。

谷子是我國北方重要的糧食作物之一，具有抗旱、耐瘠等特點。Li等[11]在全基因組水平上分析了谷子中ATG相關基因，共發現37個基因，其中有26個基因與抗旱相關，包括SiATG1、SiATG2等。以河北省農林科學院谷子研究所育種研究室培育的優質抗旱、兼抗阿特拉津和拿捕凈除草劑谷子品種冀谷34為試材，分析其ATG5結構及編碼蛋白特點，研究不同干旱處理條件下ATG5在冀谷34中的表達模式，旨為探索谷子SiATG5在響應干旱脅迫中的作用以及冀谷34的抗旱機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

谷子試材為河北省農林科學院谷子研究所育種研究室培育的優質抗旱、兼抗阿特拉津和拿捕凈除草劑品種冀谷34，其田間抗旱性為1級。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因克隆和序列分析 根據SiATG5登錄號XP_004952117，在Phytozome谷子基因組數據庫中搜索，獲得參考基因組SiATG5 DNA序列。以此序列為模板，用Primer 5.0軟件設計引物F1/R1（表1）。分別以冀谷34 DNA和干旱脅迫處理后的cDNA為模板，用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase（大連寶生物）進行擴增。PCR反應體系為50μL：含5×PCR Buffer 10μL、0.25 mmol/L dNTP 4μL、10μmol/L引物各1μL、Prime SRAR HS DNA聚合酶0.5μL、模板1μL，ddH2O補齊至50μL。PCR反應條件：98益熱激活5 s；98益變性10 s，59益退火30 s，72益延伸1.5 min，38個循環；72益保溫10 min。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，切膠回收大小約1 400 bp的目的條帶，回收產物與pEASY-Blunt Zero載體連接（北京全式金）后，轉化Trans-T1感受態細胞，挑取菌落送至上海生工生物工程股份有限公司測序，陽性克隆菌液加甘油后-80益保存。總RNA提取參照TransZol Up Plus RNA Kit（全式金）試劑盒說明書進行；cDNA第一鏈合成按照NovoScript 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒（近岸蛋白科技有限公司）說明書步驟進行；葉片DNA提取參照植物基因組DNA提取試劑盒（康為世紀生物科技有限公司）說明書進行。

利用DNAMAN軟件進行DNA和cDNA序列比對，NCBI ORF Finder分析開放閱讀框（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），PredictProtein （http：//www.predictprotein.org/）分析二級結構，利用MEGA5.0軟件進行系統進化樹構建。

表1 引物序列Table 1 Primers sequences

1.2.2 干旱脅迫處理 脅迫處理于2017年8月在河北農林科學院谷子研究所實驗室進行。在裝有細沙-土混合物（事先已滅菌）的花盆（6 cm×12 cm）中播種谷子，然后置于人工氣候箱中，在16 h光/8 h暗、30益白天/26益夜間、相對濕度65% 條件下進行培養。待谷子幼苗長至4-5片葉時，移至1/2 Hoagland營養液（pH值5.8）中培養；2 d后，選擇長勢一致的幼苗，分別移至PEG-6000濃度0（不含PEG-6000）、6% （輕度干旱）、18% （中度干旱）和30% （重度干旱）的1/2 Hoagland營養液中進行干旱脅迫處理[18]。分別在處理后6、12、24 h取葉片，置于液氮中冷凍后在-80益冰箱中保存，備用。每個處理均3次生物學重復。

1.2.3 qRT-PCR 參照SYBR Premix Ex Taq II熒光定量試劑盒說明書（TaKaRa）進行。以谷子Actin（Genbank：AF288226.1）作為內參基因，SiATG5和內參基因的qRT-PCR引物參考Li等[11]文獻，分別為F2/R2和F3/R3（表 1）。qRT-PCR在ABI StepOne Plus Real-Time PCR System上進行。每個處理均3次生物學重復，每個生物學重復均3次qRT-PCR重復。根據擴增曲線確定每個反應的Ct，以Actin為內參校正PCR模板的拷貝數。相對表達量采用2-駐駐Ct方法計算[19]。

2 結果與分析

2.1 SiATG5的克隆及序列分析

分別以抗旱品種冀谷34 DNA和6% PEG-6000干旱脅迫12 h后的cDNA為模板，擴增獲得SiATG5gDNA和cDNA全長序列。測序結果表明二者序列一致，說明SiATG5無內含子。序列分析表明，SiATG5ORF（open reading frame）全長1 092 bp，編碼363個氨基酸 （圖 1）。

圖1 SiATG5氨基酸序列Fig.1 The amino acid sequences of SiATG5

預測分子量為40.3 kD，理論等電點為5.03，平均疏水性-0.312。二級結構預測結果表明，SiATG5蛋白二級結構中琢-螺旋占34% ，茁-鏈占12% ，延伸鏈占17% ，無規則卷曲占37% ，其中含有跨膜螺旋4% （www.predictprotein.org）。YLoc在線軟件預測該蛋白位于細胞質。酵母ATG5蛋白與自噬體形成有關，自噬體位于胞質中，與SiATG5蛋白預測定位結果[20]一致。蛋白序列保守結構域分析表明，SiATG5第77-331含有APG5結構域（Pfam：PF04106），為植物和動物ATG5特有結構域。以人ATG12-ATG5復合物晶體結構（PDB ID：c4gdkB）為模板，預測SiATG5蛋白三維結構，有效預測范圍為SiATG5的262個氨基酸殘基，置信度100% ，覆蓋72% 序列。預測SiATG5蛋白三維結構（圖2）含有7個螺旋結構，7個茁片。

圖2 SiATG5蛋白的三維結構Fig.2 The predicted protein structure of SiATG5

2.2 SiATG5蛋白同源性比較

為了比較SiATG5與其他作物的同源性高低，與單子葉植物、雙子葉植物、哺乳動物和酵母中ATG5蛋白序列構建進化樹，10個物種共聚為4類，分別是單子葉植物、雙子葉植物、哺乳動物和酵母（圖2）。其中，SiATG5與高粱和玉米的同源性最高，其次是水稻和小麥，與雙子葉植物的同源性較低。

圖3 ATG5蛋白進化分析Fig.3 Evolutionary analysis of ATG5 in foxtail millet

2.3 PEG干旱脅迫下SiATG5表達模式分析

圖4 不同干旱脅迫下SiATG5在冀谷34中的表達水平Fig.4 The express level of SiATG5 in Jigu 34 under different drought stress

采用PEG-6000模擬干旱脅迫，設置輕度、中度、重度3個干旱脅迫條件，分析脅迫處理后0 h、6 h、12 h和24 h的SiATG5表達量變化情況。結果（圖4）表明，在干旱脅迫處理下，SiATG5的表達量均較對照升高。在輕度和中度干旱脅迫條件下，隨著脅迫時間的延長，SiATG5的表達量均逐漸升高，其中，輕度干旱脅迫6 h、12 h、24 h的表達量分別較對照提高了0.41倍、0.80倍和1.14倍，中度干旱脅迫6 h、12 h、24 h的表達量分別較對照提高了1.75倍、2.10倍和2.15倍。SiATG5表達量在輕度和中度干旱脅迫下隨著脅迫時間的延長而逐漸升高，以及中度干旱脅迫6 h的表達量（2.75）大于輕度干旱脅迫24 h的表達量（2.14），中度干旱脅迫下24h內的平均表達量（3.0）顯著高于輕度干旱脅迫下的平均表達量（1.78），說明SiATG5參與冀谷34的抗旱反應，該品種通過SiATG5表達量的提高應對不同的干旱脅迫條件。重度干旱脅迫6 h時表達量達到最高值（3.13），并維持到12 h，在24 h時降低，說明重度干旱脅迫時冀谷34通過迅速提高SiATG5表達量來應對干旱脅迫，但存在表達極值。

4 結論與討論

自噬相關基因在植物應答逆境脅迫過程中起重要作用。ATG5是自噬體形成過程中的一個關鍵基因，然而谷子SiATG5在抗旱脅迫中的作用及在干旱響應中的功能作用研究較少。Li等[11]利用谷子基因組數據庫鑒定了37個谷子ATG相關基因，其中26個基因受干旱、鹽脅迫誘導表達，在PEG（6% ）處理1 h和12 h后ATG5表達量均表現升高，說明ATG5與干旱脅迫相關。本研究采用PEG-6000模擬干旱脅迫，分析了輕度、中度、重度干旱脅迫6 h、12 h和24 h的SiATG5表達水平，結果表明，SiATG5在調控冀谷34的抗旱性中起著重要作用。SiATG5表達量與抗旱水平高度相關，隨著干旱程度的加重，SiATG5的表達量逐漸升高，說明SiATG5通過其表達水平的變化應對不同程度的干旱脅迫；在輕度干旱脅迫下的最高表達量（2.14）低于中度（3.15）和重度（3.13）干旱脅迫下的表達量，以及中度和重度干旱脅迫下表達量達到最高值的時間點不同，表明輕度和中度干旱對冀谷34影響較小，SiATG5表達量隨著脅迫時間的延長而提高，但在重度干旱條件下脅迫處理6 h后其表達量即達到最高值，說明此時已對冀谷34影響較大，SiATG5通過迅速提高其表達量來應對干旱脅迫。

植物抗旱是一個復雜的過程，Romain等[15]研究表明ATG5蛋白具有吞噬泡結構域，蛋白位于自噬體形成部位，是自噬體形成所必須的。ATG5突變體不能形成自噬小體。其作用機理為ATG5通過與ATG12和ATG16形成ATG12-ATG5-ATG16復合體，ATG5復合體能夠與位于自噬體膜表面的ATG8結合，從而瞄定ATG8在自噬體上，參與自噬體膜的擴展和自噬體閉合，這些基因是否參與植物的抗旱水平等也需進一步研究。