關于起草《自體CAR-T免疫細胞產品生產指南（討論稿）》的思考

王沖 付秋雁 譚建新 于玲莉 劉芬 董正龍 李建平

摘 要 本著“服務創新驅動、保障藥品質量安全”的宗旨，為支持和推動嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T cell， CAR-T）類免疫細胞產品的產業化進程，探討風險控制策略，并按藥品管理規范指導和規范這類產品的產業化，由上海藥品審評核查中心組織發起，上海市免疫細胞治療產業聯盟的相關企業共同參與，起草編撰了《自體CAR-T免疫細胞產品生產指南（討論稿）》。該生產指南經過業界專家的多次討論和多方征求意見，現已形成初稿，本文就其編撰及內容作一簡要介紹并提出相關思考，希望能給業界提供參考和借鑒。

關鍵詞 嵌合抗原受體T細胞 免疫細胞治療 生產指南

中圖分類號：R951 文獻標志碼：C 文章編號：1006-1533（2018）11-0015-06

Consideration on drafting a discussion paper on Guidelines for the Production of Autologous CAR-T Immune Cell Products

WANG Chong*， FU Qiuyan， TAN Jianxin， YU Lingli， LIU Fen， DONG Zhenglong， LI Jianping**（Shanghai Center for Drug Evaluation and Inspection， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT To discuss the risk control strategy and guide and regulate the industrialization of chimeric antigen receptor T cell （CAR-T） immune cell production according to the specifications of drug management so as to implement the strategy for the innovation-driven development and ensure drug quality and safety and promote and support the industrialization and standardization of such pharmaceuticals. The discussion paper on the Guidelines for the Production of Autologous CAR-T Immune Cell Products was drafted and compiled by Shanghai Center for Drug Evaluation and Inspection combined with the Shanghai Alliance for Immune Cell Therapy Industries. A first draft of these production guidelines was formed after many discussions and multi-party comments by industry experts. A brief introduction to its compilation and content was given and the relevant thinking was proposed in this article.

KEy WORDS chimeric antigen receptor T cell； immune cell therapy； production guidelines

諾華公司開發的CTL-019獲得美國FDA腫瘤藥物咨詢委員會全票批準推薦的消息引起了醫藥界對嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T cell， CAR-T）療法的高度關注。這是因為，CAR-T是一類區別于傳統小分子和生物藥物的新藥物形態，可為腫瘤治療提供一種新型治療手段，且其作用已基本得到全球權威藥品審評機構美國FDA的認可[1]。我國之前按照國家衛生部的相關規定和要求，參照衛生部發布的《醫療技術臨床應用管理辦法》[2]，將自體干細胞和免疫細胞療法列為第三類醫療技術予以管理。鑒于免疫細胞治療技術漸趨完善，2017年12月國家食品藥品監督管理總局藥品審評中心印發了《細胞治療產品研究與評價技術指導原則》（試行）[3]。該指導原則適用于符合《中華人民共和國藥品管理法》第一百零二條關于藥品的定義并符合以下要求的產品：①來源于人自體或異體的活細胞，但不包括生殖細胞及其相關干細胞；②可與輔助材料結合或經體外誘導分化、或進行基因改造操作的人源細胞。這意味著細胞治療產品研發可以參照《藥品注冊管理辦法》進行規范管理了。

隨著相關技術的不斷發展，全球、包括我國的免疫細胞治療產業正在迅速形成并壯大。上海市作為全國的科創中心及生物醫藥研發產業重地，在CAR-T類免疫細胞產品研發方面頗為活躍且已初具產業化基礎，跨過早期研發階段進入立項到申報前階段的企業為數不少，有些企業已有或正在建生產車間，發展水平處于國內領先地位。但國內尚無成功申報獲得批準上市的CAR-T類免疫細胞產品案例，現有的相關法規和常規的藥品管理方式又不完全適用于這類產品，研發企業正面臨申報和廠房建設要求方面的困境，監管部門也面臨如何提高專業監管能力等多方面的挑戰[4]。

為支持和推動上海市CAR-T類免疫細胞產品的產業化進程，探討風險控制策略，并按藥品管理規范指導和規范這類產品的產業化，由上海藥品審評核查中心組織發起，上海市免疫細胞治療產業聯盟相關企業共同參與，起草編撰了《自體CAR-T免疫細胞產品生產指南（討論稿）》（以下簡稱為“生產指南”）。該生產指南經過業界專家的多次討論和多方征求意見，現已形成初稿，本文就其編撰依據及主要內容作一簡要的框架性介紹并提出相關思考。

1 編撰依據

《藥品生產質量管理規范（2010年修訂）》[5]、《藥品生產質量管理規范（2010年修訂）》附錄1“無菌藥品”[6]和歐盟發布的《Guidelines on Good Manufacturing Practice specific to Advanced Therapy Medicinal Products》[7]。

2 主要內容

CAR-T是一類新型免疫細胞產品，其由符合倫理學要求的細胞經體外培養和嵌入針對特定抗體的抗原制成。本生產指南旨在為CAR-T類免疫細胞產品的規范生產和質量控制提供參考和借鑒，并探討了風險控制策略。

2.1 廠址選擇和廠房整體布局

為降低污染和交叉污染風險，廠房、生產設施及設備應根據所生產藥品的特性、工藝流程和相應的潔凈度級別要求合理設計、布局和使用。

2.1.1 生產區和貯存區

生產區和貯存區應有足夠的空間，以確保能有序地存放設備、物料、中間產品、待包裝產品和成品，避免不同產品或物料的混淆、交叉污染，避免生產或質量控制操作發生遺漏或差錯。

應根據藥品品種、生產操作要求和外部環境狀況等配置空調凈化系統，使生產區有效通風，并有溫度、濕度控制和空氣凈化過濾，保證藥品的生產環境符合要求。潔凈區與非潔凈區之間、不同級別潔凈區之間的壓差應≥10 Pa；必要時，相同潔凈度級別的不同功能區域（操作間）之間也應保持適當的壓差梯度。

2.1.2 生產中間控制區

生產中間控制區如設置在潔凈生產車間內部，應避免交叉污染、混淆等藥品質量風險。

2.1.3 倉儲區

倉儲區的設置和分區應避免不同產品或物料的混淆和交叉污染。①體細胞接收區：應每份體細胞均貼有完整標簽，進行唯一識別碼登記、編錄和標識。應有獨立的血液樣本存放冰箱，并根據生產工藝合理制定血液樣本的接收、儲存和發放規程。②原輔料儲存區：同藥品GMP。③CAR-T產品儲存區：應注意液氮罐補充液氮的便捷性，并對液氮儲存條件進行適當的監測。使用不同液氮罐或同一液氮罐、但不同欄架儲存待檢品、成品、留樣和穩定性考察的CAR-T產品時，應進行必要的風險評估，并采取相應的控制措施。

2.1.4 質量控制區

一般需分為體細胞檢測區、細胞檢測區、微生物檢測區、理化檢測區和分子檢測區等。體細胞檢測區應獨立設置，使用專用檢驗設備，并應配備原位滅活或消毒的設備。如有空調凈化系統，應獨立設置。應有獨立的分子檢測區域，以避免氣溶膠的產生與交叉污染。分子檢測區域應至少包括試劑準備、標本制備和基因擴增三個功能操作間，三個功能操作間應相互獨立，避免空氣的直接流通，以避免交叉污染。如具備條件，建議每個區域配置緩沖間?；陲L險，部分區域應設置獨立的廢氣排放系統。

2.1.5 輔助區

包括清洗清潔區、滅菌區和廢棄物處理區。應有獨立的廢棄物處理區，對生物活性物質進行滅活處理。

2.2 生產設備

主要生產設備如生物安全柜、離心機、冰箱、顯微鏡、純化設備、過濾設備和泵等的設計或選型、校驗、清洗和維護的要求同藥品GMP。宜使用一次性系統，以避免污染和交叉污染。

CAR-T產品生產中需用到一些特殊設備。①分選設備：分選設備一般為含有磁力的設備系統，操作和放置時應注意周圍不得有磁性物體，以避免干擾及長期干擾后產生磁性。②中間體檢測用到的設備：常用的中間體檢測設備如流式細胞儀、細胞計數儀和顯微鏡的設計或選型、校驗、清洗和維護的要求同藥品GMP。

質粒、病毒載體和CAR-T產品的生產區應分別設置為獨立區域，病毒載體和CAR-T產品的生產不應共用空調凈化系統。

2.2.1 質粒生產設備

在CAR-T產品的生產過程中，如有質粒中間品，應有獨立的質粒生產區。質粒生產區內應至少包括發酵、純化和除菌分裝三個功能區，其中發酵和純化功能區至少為控制區，除菌分裝功能區的潔凈度至少為“C+A”。宜選用耐高溫高壓滅菌的系統或一次性發酵系統，以避免不同種質粒或不同批次質粒的交叉污染。如未使用耐高溫高壓滅菌的系統或一次性發酵系統，則至少每種質粒發酵使用一種系統。不同種質粒的純化不得共用同一純化層析柱和層析介質。由于質粒的生產宿主是革蘭陰性菌大腸埃希菌，純化系統應確保能有效去除宿主菌殘留的內毒素。

2.2.2 病毒載體生產設備

病毒載體的生產區應符合藥品GMP要求。病毒載體生產區應至少分為細胞培養、病毒轉染（如有）、病毒純化和除菌過濾等功能區。應選用耐高溫高壓滅菌的系統或一次性發酵系統，以避免不同批次的交叉污染及外源性微生物污染。

2.2.3 CAR-T產品生產設備

CAR-T產品的生產區應符合藥品GMP要求。CAR-T產品生產區應至少分為體細胞分離分選、細胞擴增和細胞冷凍（如有）等功能區。CAR-T產品的生產應符合無菌技術操作規范。為避免不同來源T細胞的交叉污染，CAR-T產品生產過程中宜選用一次性生產用耗材。

如CAR-T產品的生產采用非全封閉系統操作，應避免不同供者來源體細胞的CAR-T產品生產發生交叉污染、污染和混淆，操作完畢后須清場；如CAR-T產品的生產采用了全封閉系統操作，應注意避免在取樣、加樣等環節可能發生的交叉污染。對部分非全封閉系統操作，應按非全封閉系統要求執行。

2.2.4 公用系統

壓縮空氣、二氧化碳和氧氣（同藥品GMP要求）。水系統（同藥品GMP要求）。

2.3 生產過程

CAR-T產品生產主要分為三個生產過程。①質粒生產過程（如有）：至少包括細菌復蘇、細菌擴增、細菌破碎、質粒純化和除菌過濾等工藝流程。②病毒載體生產過程：至少包括細胞擴增、質粒轉染（如有）、病毒收獲、病毒純化和除菌過濾等工藝流程。③CAR-T產品生產過程：至少包括細胞分離、細胞分選（如有）、T細胞激活、病毒感染、細胞擴增、細胞收獲和細胞冷凍（如有）等工藝流程。

2.3.1 質粒生產過程（如有）

質粒生產以復蘇攜帶質粒的工程菌為起始點，經細菌擴增，收獲細菌，裂解、破碎菌體后釋放質粒，去除相關細菌蛋白和細菌基因組，去除細菌內毒素，純化得超螺旋質粒，最后除菌過濾獲得質粒中間品。

2.3.2 病毒載體生產過程

病毒載體的生產過程如下：擴增生產細胞至一定規模（如采用瞬轉工藝，則需投入質粒和轉染復合物以包裝出目的病毒），收獲病毒上清液，經純化和去除牛血清白蛋白、DNA和蛋白等雜質后，濃縮至一定滴度，最后除菌過濾獲得病毒載體中間品。

2.3.3 CAR-T產品生產過程

CAR-T產品的生產需先獲取供者或患者的免疫細胞，經分離、分選（如有）獲得T細胞，激活后再使用病毒載體感染T細胞，擴增生產至一定量，收獲CAR-T并清洗。

2.3.4 非冷凍制劑生產過程

在清洗后的CAR-T中加入生理鹽水或其他藥用輔料，分裝至輸血袋。

2.3.5 冷凍制劑生產過程

加入冷凍保護劑，分裝至凍存袋，從室溫冷凍至液氮溫度后保存。

2.4 物料

2.4.1 質量標準和標識

參照《中華人民共和國藥典》2015年版三部生物制品通則中“生物制品生產用原材料及輔料質量控制規程”對生物制品生產過程中使用的原材料和輔料質量控制的通用性要求。

2.4.1.1 血液樣本唯一識別碼

供者或患者體細胞的獲得應符合倫理學要求，體細胞從入庫至生產、檢定應編制唯一識別碼，并使用該識別碼作為對應來源的唯一憑證，同時必須保護隱私信息。

2.4.1.2 物料供應商管理

物料供應商應提供物料質量證明文件或合格證，部分進口試劑和耗材應有進口許可文件。

2.4.2 物料和產品的接收

同《藥品生產質量管理規范（2010年修訂）》附錄3中“生物制品”的要求。

2.4.3 生產過程中的物料管理

同藥品GMP，注意質粒（如有）和病毒載體的留樣。

2.4.4 檢驗與放行

2.4.4.1 CAR-T制劑的快速檢驗與放行

應制定有條件放行的質量標準，以備臨床急需。應將重點放在安全性檢測項目方面，如無菌檢查、支原體檢查和病毒自我復制能力檢查等。

2.4.4.2 CAR-T制劑的標準檢驗與放行

應制定適用的檢驗方法與放行質量標準。

2.4.5 包裝和運輸儲存

CAR-T制劑的外包裝上應明確患者的相關信息，外包裝材料宜選用保溫隔熱材料。

如CAR-T制劑保存在液氮中，應注意避免不同批次和不同供者來源的制劑混淆及相互污染，同時對液氮儲存條件進行適當的監測。CAR-T制劑運輸時應保存在液氮或干冰中，應測試運輸條件的穩定性，運輸過程中也應對溫度進行持續的監測。

在CAR-T制劑出庫發貨時應核對其唯一識別碼，并建立醫療機構接收回執，內容至少包括制劑袋外觀檢查、輸液口完整性檢查、接收時間及數量等。

2.5 確認和驗證

2.5.1 無抗生素培養無菌工藝模擬驗證

在CAR-T產品的生產過程中應進行無抗生素培養無菌模擬工藝驗證，以證明生產體系的無菌性、無支原體性。驗證時宜選用生產用培養基、緩沖液或增菌培養基等模擬最優和最差培養環境，以驗證CAR-T產品的無菌性。

2.5.2 總體工藝驗證

通常情況下，工藝驗證應至少包括常規生產條件下的三個連續批。如使用其他批數量，應考慮可否通過使用標準生產方法、已有相似產品或工藝、起始物料的可變性、臨床適應證等予以合理解釋。

對多種質粒生產系統，如生產工藝相同，基于風險評估，可只對其中一種質粒中間品進行工藝驗證，結果需符合質粒中間品的質量標準。

CAR-T產品的生產可使用不同來源的T細胞，但結果均需符合CAR-T產品的質量標準。

2.5.3 清潔驗證

2.5.3.1 質粒純化系統（如有）

質粒的純化系統如為非一次性系統，應進行清潔驗證。

2.5.3.2 病毒載體純化系統

病毒載體的純化系統如為非一次性系統，應進行清潔驗證。

2.5.3.3 CAR-T產品純化系統

CAR-T產品的純化系統如為非一次性或非全封閉系統，清潔驗證應驗證細菌、真菌、分枝桿菌和支原體等項目，以避免交叉污染。如同一個CAR-T產品純化車間涉及不同種的病毒載體，應進行批間清潔，并對清潔效果進行病毒載體去除驗證。

2.6 關鍵控制項目

病毒載體滴度：病毒載體滴度的檢測方法應經驗證，確定感染復數范圍，確保感染效率符合質量標準。

T細胞占比和T細胞數：對來源于供者的外周血細胞，經分離、分選（如有）獲得T細胞群后，應檢測其中的T細胞占比和T細胞數。

CAR-T的CAR+占比：病毒感染72 h后，一般宜檢測CAR-T的CAR+占比，因為CAR-T在擴增過程中其CAR+占比可能會下降，導致CAR-T產品的CAR+占比不符合質量標準。

3 挑戰與思考

3.1 認知的時代性

本生產指南是主要基于目前的認知提出的有關CAR-T類免疫細胞產品良好生產規范方面的一般考慮。隨著相關技術發展、認知提高和經驗積累，對這類產品生產規范方面的認識必會更加深入、細化和提高。

3.2 個體化治療產品的特殊性

CAR-T類免疫細胞產品屬個體化治療產品，來源于不同供者的T細胞給生產工藝的標準化和產品的一致性帶來了極大的挑戰，決定了這類產品在生產的不同工序階段可能存在著不同的工藝控制路徑。因此，相對于傳統藥品的管理，如何保證這類產品的安全、有效和質量可控具有極大的挑戰性。

3.3 為臨床試驗用樣品生產規范提供參考

基于CAR-T類免疫細胞產品的特殊性，這類產品的研究與開發周期與傳統藥物相比相對較短，因此多數研發機構在早期的生產工藝開發階段就考慮到了后續臨床試驗用樣品以及商業化生產的需求。本生產指南同樣可為臨床試驗用CAR-T類免疫細胞產品的生產規范提供參考。

3.4 其他類別細胞治療產品的適用性

本生產指南為CAR-T類免疫細胞產品的規范生產提供參考和建議，以支持和推動這類產品的產業化進程。對其他類別的細胞治療產品，本生產指南僅供借鑒，但有些通用原則應是基本相同的。

3.5 CAR-T產品的臨床需求日益增加

CAR-T類免疫細胞療法的發展十分迅速，為腫瘤治療提供了一種新的有效手段。然而，在學術研究階段，CAR-T產品的生產往往采用科研級別的耗材且未使用全自動生產系統，成本高、生產效率低，無法進行大規模生產。由于臨床上對CAR-T產品的需求日益增加，因此可考慮在研發階段即采用臨床許可耗材并設計全封閉的生產系統等，進而加快研發進程。

4 結語

為貫徹落實國家對藥品審評審批制度改革的要求，支持和推進上海市前沿生物制藥的產業化進程，更好地保障藥品質量和安全，上海藥品審評核查中心積極創新，專門組建了生物組，主動探索以品種為主線的全鏈條監管模式。本生產指南是上海藥品審評核查中心生物組探索藥品全鏈條監管模式的重要舉措之一，希望能實現以監管創新推動藥品創新的目標。

致謝：感謝上海食品藥品檢驗所生化藥品生物制品室陳鋼主任、國家上海新藥安全評價研究中心常艷主任、華道（上海）生物醫藥有限公司、上海恒潤達生生物科技有限公司、科濟生物醫藥（上海）有限公司、復星凱特生物科技有限公司、上海藥明巨諾生物科技有限公司和通用電氣醫療集團生命科學部對本生產指南編撰所給予的專業建議和大力支持；感謝上海藥品審評核查中心生物組成員吳浩、張一瓊、曹萌、丁力承和劉凌毅對本生產指南編撰的辛勤付出。

參考文獻

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