TaGAMyb-B等位變異與小麥株高和第二節間細胞長度的相關性

劉 夢，王 增，李淑芬，劉進英，馮玉梅，楊 燕

(內蒙古農業大學生命科學學院植物生物技術功能實驗室/內蒙古自治區植物逆境生理與分子生物學重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010018)

小麥株高不僅影響產量，同時還與抗倒伏性密切相關[1]。在育種實踐中，一般認為株高分布在75～85 cm的小麥品種不易發生倒伏，且能發揮高產潛能[2]。小麥[3-4]、大麥[5]和燕麥[6]的植株莖稈直徑和莖壁厚度與抗倒伏性呈負相關，即抗倒伏品種較易倒伏品種表現出較大的基部直徑和較厚的稈壁[7]。小麥莖稈基部第一和第二節間長度與倒伏指數呈顯著負相關，且基部節間對小麥倒伏性的影響表現為第二節間>第一節間>第三節間[8]。李金才等[9]的研究也驗證了小麥莖稈基部第二節間長度與倒伏性密切相關。在由表皮、維管束、厚壁組織和髓腔組成的小麥莖稈橫切面中，厚壁組織的細胞壁堅硬而起到支持作用，與植株倒伏性狀密切相關[10]。

赤霉素作為植物重要的內源性生長調節劑，在植物整個生長發育過程中起到重要的調節作用。GAMyb是參與GA信號轉導途徑的正向調節因子，能夠促進種子成熟，胚乳和花的發育、莖稈伸長等過程[11-13]。目前，GAMyb同源基因已經從大麥、水稻、小麥禾本科植物中鑒定出來，并確定其為單拷貝基因，通過結合到一個高度保守的由21個堿基對組成的GA應答元件來誘導與發芽相關的水解蛋白酶和細胞壁降解酶的合成[14-18]。同時GAMyb也與植株的莖稈伸長密切相關[19]。在擬南芥中，GAMyb卻是一個具有三個拷貝的家族，并促進葉柄和節間伸長[20]。近些年對小麥TaGAMyb的研究較廣泛和深入，TaGAMyb已經被克隆并定位在小麥染色體的3AL3-0.42-0.78、3BL7-0.63-1.00和3DL3-0.81-1.00位置上，且B和D基因組TaGAMyb的核酸多態性較保守的A基因組來說更豐富[20]。TaGAMyb基因在花藥形成和莖稈的伸長中起重要作用[19，21]。進一步研究發現，在雜交小麥后代中TaGAMyb基因對莖伸長的調節作用可能是因為TaGAMyb基因上調，導致GAMyb調節靶基因表達的增強[22]。這些數據初步表明，TaGAMyb促進小麥莖的伸長，但其在節間伸長中的作用需要進一步的驗證。劉進英等[23]在不同株高和不同遺傳背景材料中沒有發現TaGAMyb-A和TaGAMyb-D基因存在等位變異，只發現TaGAMyb-B存在兩種等位變異TaGAMyb-Ba和TaGAMyb-Bb；與TaGAMyb-Ba基因相比，TaGAMyb-Bb基因在第一內含子上存在一個84 bp反向重復序列的插入。本研究在本課題組前期工作[23]的基礎之上，進一步探討TaGAMyb-Ba和TaGAMyb-Bb與小麥株高和第二節間細胞長度的關系，以期深入了解這兩種等位變異對小麥莖稈生長發育的調節作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為93份春小麥育種材料的自然群體，由內蒙古巴彥淖爾市農科所提供。2015年和2016年播種于內蒙古呼和浩特市，行長2 m，株距15 cm，行距20 cm，設置兩個重復。

1.2 株高測定

在小麥臘熟期，對93份春小麥育種材料進行株高測量，每個重復統計10株。

1.3 引物的設計

根據TaGAMyb-A、TaGAMyb-B和TaGAMyb-D基因序列差異位點[22]以及RT-qPCR引物片段適中性原則設計引物對TaGAMyb-Bup/TaGAMyb-Bdown(表1)，對第二節間的TaGAMyb-B基因進行RT-qPCR定量檢測，同時用小麥管家基因β-actin表達量作為TaGAMyb-B基因相對表達量的參照標準，引物為Actin up/Actin down(序列見表1)。用檢測TaGAMyb-B等位基因的引物GAMyb-B2 up/GAMyb-B2 down(表1)[23]對93份春小麥材料進行多態性檢測，所用引物序列均由華大基因合成。

1.4 TaGAMyb-B的RT-qPCR檢測分析

隨機選取分別屬于TaGAMyb-Ba和TaGAMyb-Bb等位基因類型的材料各三份，分別是08冬中788、08冬中1146和08冬中275(TaGAMyb-Bb類型)以及格蘭尼、拉繁8和青春37(TaGAMyb-Ba類型)，在小麥開花后30 d取基部第二節間為試驗材料，進行TaGAMyb-B基因RT-qPCR檢測分析。利用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa)提取總RNA，并取2 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析檢測總RNA的完整性，用核酸定量儀(Thermo Nanodrop-2000)測定核酸的濃度和檢測總RNA的純度。以總RNA為模板，利用反轉錄試劑盒RTaseM-MLV(TaKaRa)(200 U·μL-1)合成第一條cDNA鏈。以反轉錄得到的第一條cDNA鏈為模板，利用小麥管家基因β-actin檢測反轉錄過程的完整性。反應體系(15 μL)：ddH2O 10.55 μL、10×PCR Buffer 1.5 μL、dNTP Mix(2.5 mmol·L-1) 1.2 μL、上下游引物(20 mmol·L-1)各0.3 μL、LA Taq酶(5 U·μL-1，TaKaRa)0.15 μL和模板cDNA 100 ng。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠檢測。

表1 本研究引物信息Table 1 Information of primers in this study

RT-qPCR分析反應體系為20 μL，包括SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，上下游引物(20 mmol·L-1)各1 μL，ddH2O 6 μL，cDNA(500 ng·μL-1)2 μL。每個材料進行三次生物學重復，反應條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，循環40次。電腦自動分析計算CT值。

樣品中基因表達量變化倍數運用2-△△CT法計算[24]。其中△△CT=△CT(參照)-△CT(處理)，△CT=CT(目標基因)-CT(內參基因)。

1.5 冷凍切片樣品的制備與觀察

選取小麥開花后30 d莖稈基部第二節間作為試驗材料。樣品剪成約0.5 cm的小段，用LEICA OCT包埋劑進行包埋。放于-20 ℃冰箱冷藏2 h，然后放于-80 ℃備用。用LEICA CM3050S冷凍切片機進行切片，厚度為20 μm。用小毛刷將切片展平，用粘附載玻片粘樣，最后放于Nikon eclipse Ti下進行觀察，選用綠色濾光片。

1.6 數據的分析

用Microsoft Excel 2010對株高數據進行差異顯著性分析，用SPSS對株高數據進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 春小麥株高表型的差異

測定結果顯示，兩年中，93份春小麥株高分布范圍為51.25～97.97 cm，平均值為70.49 cm。其中，株高最高材料為拉繁8(97.97 cm)，株高最低材料為08冬中788(51.25 cm)。93份春小麥材料中，株高在75～85 cm間的有16份材料，占比為17.2%(表2)。該群體在2015年和2016年的株高呈極顯著正相關(R=0.719，P<0.01)，說明兩年的株高表現是一致的。

2.2 TaGAMyb-B等位基因的鑒定結果及相應材料株高分布

用引物GAMyb-B2 up/GAMyb-B2 down對93份春小麥材料進行多態性檢測，在93份材料中檢測出TaGAMyb-Ba和TaGAMyb-Bb兩種等位基因(圖1和表2)，其中，有31份小麥材料屬于TaGAMyb-Ba等位基因型，62份小麥材料屬于TaGAMyb-Bb等位基因型。TaGAMyb-Ba等位基因型株高分布范圍為51.45～97.97 cm，最高株高材料為拉繁8(97.97 cm)，最低株高材料為寧春10號(51.45 cm)；分布在最適種植株高75～85 cm范圍的有8份材料，分別是05cm178、鑒56、沈太1號、拉2676-9、青春37、寧資08A751、34-206和沈免210848，占比為25.80%，株高分別為77.28、83.96、82.45、80.51、79.44、76.81、75.96和75.89 cm。TaGAMyb-Bb等位基因型的株高分布范圍為51.25～91.49 cm，最高株高材料為中國春(91.49 cm)，最低株高材料為08冬中788(51.25 cm)；分布在75～85 cm范圍的也有8份材料，分別為九三大穗/山東7788、甘春20號、小冰32、內麥17號、08H274、G47、05-5371和張春11，占比為12.90%，株高分別為83.44、81.63、80.27、79.89、79.44、77.93、76.88和75.08 cm。由此可見，該自然群體中TaGAMyb-Ba等位基因型材料在最適種植株高75～85 cm范圍中的占比大于TaGAMyb-Bb等位基因型材料。

2.3 TaGAMyb-Ba和TaGAMyb-Bb與小麥株高的相關性

2015和2016年TaGAMyb-Ba基因型的株高平均值分別為70.00±9.36和76.86±9.57 cm，兩年均以拉繁8最高，寧春10號最低；TaGAMyb-Bb基因型的株高平均值兩年分別為65.79±7.81和72.07±9.74 cm，兩年分別以野貓和河套3號最高，以08冬中550和08冬中788最低。方差分析表明，同一年內兩種基因型間株高差異均顯著(P2015=0.024，P2016=0.027)；兩個基因型的兩年平均值分別為73.43±8.62和68.93±8.18 cm，也存在顯著差異(P=0.016)。

M：Marker DL2000；1、5和6均為TaGAMyb-Bb等位基因型材料(08冬中788、08冬中1146和08冬中275)；2、3和4均為TaGAMyb-Ba等位基因型材料(格蘭尼、拉繁8和青春37)。

M:Marker DL2000; 1,5 and 6 areTaGAMyb-Bballele materials(08 dongzhong 788,08 dongzhong 1146 and 08 dongzhong 275); 2,3 and 4 are cultivars withTaGAMyb-Baallele(Gelanni,Lafan 8 and Qingchun 37).

圖1 GAMyb-B等位基因在93份春小麥材料中的部分擴增結果

(續表2Continuedtable2)

材料Material基因型Gene type株高 Plant height/cm2016年2015年兩年平均值Average in two years07-6228TaGAMyb-Bb73.07 66.79 69.93 08-1783TaGAMyb-Bb75.46 66.83 71.15 青春37 Qingchun 37TaGAMyb-Ba86.84 72.04 79.44 08冬中275 08 dongzhong 275TaGAMyb-Bb65.00 58.99 62.00 08H274TaGAMyb-Bb81.86 77.01 79.44 永登麥 YongdengmaiTaGAMyb-Bb74.50 66.67 70.58 08冬中5378 08 dongzhong 5378TaGAMyb-Ba77.75 66.58 72.16 永2352 Yong 2352TaGAMyb-Ba73.33 67.13 70.23 武M27-2 Wu M27-2TaGAMyb-Ba74.75 59.02 66.89 河套3號 Hetao 3TaGAMyb-Bb99.75 77.02 88.39 沈太1號 Shentai 3TaGAMyb-Ba84.83 80.07 82.45 金穗0095 Jinsui 0095TaGAMyb-Ba77.75 61.17 69.46 巴豐3號 Bafeng 3TaGAMyb-Bb77.50 59.44 68.47 蘭優5074 Lanyou 5074TaGAMyb-Ba78.06 61.90 69.98 寧資08A751 Ningzi 08A751TaGAMyb-Ba85.22 68.40 76.81 蘭雜7002 Lanza 7002TaGAMyb-Ba78.50 63.78 71.14 07-6751TaGAMyb-Ba77.50 70.30 73.90 y31TaGAMyb-Bb77.09 64.71 70.90 小冰32 Xiaobing 32TaGAMyb-Bb86.77 73.77 80.27 鑒56 Jian 56TaGAMyb-Ba84.91 83.01 83.96 福建7112 Fujian 7112TaGAMyb-Ba79.13 62.17 70.65 遼春10號 Liaochun 10TaGAMyb-Ba70.00 76.30 73.15 08-353TaGAMyb-Ba80.94 67.66 74.30 青海932 Qinghai 932TaGAMyb-Bb74.29 60.96 67.63 84加79 84 jia 79TaGAMyb-Bb68.25 67.38 67.81 82170-1TaGAMyb-Ba73.92 60.90 67.41 08冬中1807 08 dongzhong 1807TaGAMyb-Bb76.43 57.24 66.84 野貓 YemaoTaGAMyb-Bb86.56 85.47 86.02 甘春20號 Ganchun 20TaGAMyb-Bb83.08 80.17 81.63 輪選 LunxuanTaGAMyb-Bb73.17 63.65 68.41 臨優一號 Linyou 1TaGAMyb-Bb77.11 66.53 71.82 巴優1號 Bayou 1TaGAMyb-Bb78.38 64.85 71.62 九三大穗/山東7788 Jiusandasui/Shandong 7788TaGAMyb-Bb82.58 84.31 83.44 寧春10號 Ningchun 10TaGAMyb-Ba51.40 51.50 51.45 08-1312TaGAMyb-Bb69.25 65.99 67.62 巴豐6號 Bafeng 6TaGAMyb-Ba74.38 71.59 72.98 永2739 Yong 2739TaGAMyb-Bb73.00 62.08 67.54 08冬中6741 08 dongzhong 6741TaGAMyb-Bb55.79 53.00 54.39 07-6239TaGAMyb-Bb74.17 67.08 70.63 08-2294TaGAMyb-Bb84.23 65.75 74.99 08-3410TaGAMyb-Ba81.50 66.73 74.12 寧春35號 Ningchun 35TaGAMyb-Bb78.40 67.27 72.84 張春11 Zhanchun 11TaGAMyb-Bb80.38 69.79 75.08 張掖1號 Zhangye 1TaGAMyb-Bb75.75 64.00 69.88 中國春 Chinese SpringTaGAMyb-Bb98.00 84.99 91.49 武M437 Wu M437TaGAMyb-Ba71.90 63.95 67.93 08-1826TaGAMyb-Bb72.25 62.60 67.43 08-3348TaGAMyb-Bb77.58 63.33 70.45 08-1718TaGAMyb-Bb72.85 62.46 67.66 08-1699TaGAMyb-Bb75.90 63.29 69.59 矮孟牛 AimengniuTaGAMyb-Bb69.75 55.95 62.85 73B609TaGAMyb-Bb77.81 71.42 74.62 08冬中2455 08 dongzhong 2455TaGAMyb-Bb58.56 54.80 56.68 YK6-325TaGAMyb-Bb64.42 66.80 65.61 武E32-1 Wu E32-1TaGAMyb-Ba79.45 70.15 74.80 巴豐1號 Bafeng 1TaGAMyb-Bb69.40 58.89 64.14 臨優二號 Linyou 2TaGAMyb-Bb64.69 64.94 64.81

2.4 TaGAMyb-B基因在小麥莖稈第二節間中的表達

在小麥莖稈第二節間中，TaGAMyb-Ba基因的表達量均高于TaGAMyb-Bb基因，但差異不顯著(P=0.120)(圖2)。

1：08冬中788(TaGAMyb-Bb)；2：08冬中1146(TaGAMyb-Bb)；3：08冬中275(TaGAMyb-Bb)；4：格蘭尼(TaGAMyb-Ba)；5：拉繁8(TaGAMyb-Ba)；6：青春37(TaGAMyb-Ba)。相對表達量以1(08冬中788)為標準進行均一化處理。

1:08 dongzhong 788(TaGAMyb-Bb); 2:08 dongzhong 1146(TaGAMyb-Bb); 3:08 dongzhong 275(TaGAMyb-Bb); 4:Gelanni(TaGAMyb-Ba); 5:Lafan(TaGAMyb-Ba); 6:Qingchun 37(TaGAMyb-Ba). The relative expression was homogenized with 08 dongzhong 788 as the standard.

圖2TaGAMyb-B在小麥莖稈第二節間中的表達量

Fig.2ExpressionofTaGAMyb-Binthesecondinternodeofwheatstem

2.5 小麥莖稈第二節間厚壁組織的變異

對6份小麥材料莖稈第二節間橫切面(圖3)的厚壁組織厚度進行測量，結果表明，屬于TaGAMyb-Bb基因型的08冬中788、08冬中1146和08冬中275的厚壁組織厚度分別為990.52、563.68和904.31 μm；屬于TaGAMyb-Ba基因型的格蘭尼、拉繁8和青春37的厚壁組織厚度分別為1 006.68、854.65和853.66 μm。進一步分析發現，兩種基因型材料間厚壁組織厚度無顯著差異(P=0.57)。對這6份材料第二節間進行縱切，除拉繁8沒能切出完整細胞外，其他5份材料均有完整細胞(圖4)。統計每種材料中連續分布的30個厚壁細胞的長度，結果表明，TaGAMyb-Ba基因型材料格蘭尼和青春37的厚壁細胞平均長度分別為240.67和267.45 μm，二者間差異不顯著；屬于TaGAMyb-Bb基因型的08冬中788、08冬中1146和08冬中275厚壁組織細胞的平均長度分別為212.70、202.47和185.28 μm，三者間差異不顯著。TaGAMyb-Ba和TaGAMyb-Bb基因型材料的厚壁組織細胞平均長度分別為254.06和200.15 μm，二者間差異顯著(P=0.03)。

圖3 兩種等位基因類型小麥的第二莖間橫切面

3 討 論

本研究中，TaGAMyb-Ba基因型小麥兩年平均株高(73.43 cm)顯著高于TaGAMyb-Bb基因型小麥(68.93 cm)(P<0.05)。然而田間表型鑒定中，有部分材料卻與此結論相悖。例如在TaGAMyb-Ba基因型小麥中，交原356和寧春10號的平均株高分別為58.10和51.45 cm；在TaGAMyb-Bb基因型小麥中，中國春、野貓和河套3號的平均株高分別為91.49、86.02和88.39 cm。這些材料的株高均與相應變異類型的平均值差異較大，原因可能是株高作為一個多基因控制的數量性狀，在其建成過程中，除受TaGAMyb-B基因調控之外，還受 Rht8、Rht-B1、 Rht-D1、GA20ox、GA3ox等其他遺傳因素[17，24]以及環境因素的共同影響[27]。對6份材料莖稈第二節間的TaGAMyb-B相對表達量與相應株高的相關分析結果顯示，兩者之間沒有顯著的相關性(R=0.768,P=0.074>0.05)，可能是由于試驗樣本少造成了結果的局限性。青春37(TaGAMyb-Ba)莖稈第二節間的厚壁細胞最長，并且在6份材料中TaGAMyb-Ba的表達量最高，但其平均株高卻不是最高。這一結果進一步體現出小麥株高性狀是一個多基因控制的復雜數量性狀，影響株高的因素還需要更加深入的探討。結合TaGAMyb-B在基部第二節間相對表達量TaGAMyb-Ba類型材料的轉錄本表達量均高于TaGAMyb-Bb類型材料，證明TaGAMyb-B是影響株高建成的主效基因之一。這一研究結果將會在重組自交群體(兩親本株高差異大，且分別屬于TaGAMyb-Ba和TaGAMyb-Bb兩種等位變異類型)中進一步進行驗證；并且通過轉基因的途徑來研究TaGAMyb-Ba和TaGAMyb-Bb兩種等位變異類型對小麥株高的影響。

圖4 兩種等位變異類型小麥的第二莖間縱切面

小麥莖稈結構由外及里依次為表皮、厚壁組織、維管束、薄壁組織和髓腔，其中厚壁組織起到支撐莖稈的作用。組織學觀察表明，TaGAMyb-Ba和TaGAMyb-Bb兩種基因型材料間莖稈第二節間厚壁組織厚度沒有明顯差異，但厚壁組織的細胞長度存在顯著差異，且TaGAMyb-Ba基因型材料細胞長度顯著長于TaGAMyb-Bb基因型材料，進一步證明了TaGAMyb-B是影響細胞伸長的一個重要因子，TaGAMyb-Ba對小麥第二節間的細胞伸長具有促進作用，有助于株高的建成，不利于抗倒伏。

與TaGAMyb-Ba相比，等位基因TaGAMyb-Bb在第一內含子中存在一個反向重復的84 bp 插入序列，該序列與小麥中國春的一個腳手架基因(GenBank登錄號為HG670306.1)有100%的同源性[23]。反向重復序列在雙鏈DNA中可能引起十字形結構的形成，存在于某些轉座子末端，發揮重要作用[25]。對轉座子的研究表明，不同的轉座子產生不同的小RNA，對不同基因的表達進行調控[26]。結合莖稈第二節間縱切結果，推測TaGAMyb-Bb等位基因相對于TaGAMyb-Ba等位基因來說，第一內含子中存在的84 bp插入可能扮演轉座子的角色，產生小RNA來調節細胞伸長相關基因的表達，從而造成細胞間長度的差異，影響株高。