熏蒸浸提法測定堿性土微生物生物量碳初探①

劉雨晴，朱小琴，胡會峰*，張金波

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熏蒸浸提法測定堿性土微生物生物量碳初探①

劉雨晴1,2，朱小琴2，胡會峰2*，張金波1

(1南京師范大學地理科學學院，南京 210023；2中國科學院植物研究所植被與環境變化國家重點實驗室，北京 100093)

為探究熏蒸浸提法測定堿性土壤微生物生物量碳(microbial biomass carbon，MBC)的最優熏蒸時間和浸提液濃度，本研究采用9種熏蒸時間、2種K2SO4浸提液濃度對不同有機質含量的堿性土壤MBC進行了測定。結果表明：①對于堿性土壤，熏蒸時間的選擇與土壤有機質含量有關，土壤有機質含量越高，MBC提取值達到穩定的熏蒸時間越長。建議測定高有機質土壤(≥60 g/kg)MBC時熏蒸時間不少于24 h；測定中、低有機質土壤(≤30g/kg)MBC時熏蒸時間不少于18 h。②土壤有機質含量影響K2SO4浸提液的提取效率，測定高、中有機質土壤MBC時需要0.5 mol/L K2SO4浸提液進行提取；在低有機質土壤MBC測定中，0.25 mol/L K2SO4浸提液即可。③對于未知有機質含量的堿性土壤建議氯仿熏蒸時間至少為24 h，K2SO4浸提液濃度為0.5 mol/L。

氯仿熏蒸；熏蒸時間；堿性土；有機質；微生物生物量碳

土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分，直接參與土壤中能量和養分的循環轉化[1-2]。土壤微生物生物量是指除了植物根系和體積大于5×103μm3的土壤動物以外的所有活有機體的量，是土壤養分的儲存庫，是植物所需營養物質的重要來源[3-4]。因此，如何準確提取并測定土壤微生物生物量，尤其是土壤微生物生物量碳(microbial biomass carbon, MBC)對土壤微生物生態系統研究具有重要的意義。目前，MBC測定方法主要有直接鏡檢法、熏蒸培養法[5]、熏蒸浸提法[6-7]、成分分析等方法，其中熏蒸浸提法因其操作簡單、測量快速、適用土壤范圍較廣等優點，得到廣泛應用。但是，熏蒸浸提法本身并不完善，曾有研究發現浸提效率受到土壤含水率[8]、土壤質地[9]、轉換系數ec[10]以及浸提過程中土液比等因素的影響。因此，優化土壤MBC的提取方法對其精確測定具有重要的意義。

之前的研究表明，熏蒸時間和浸提液濃度是影響MBC測定的重要影響因素[11-12]。熏蒸浸提法由Brooks于1985年提出，研究發現酸性土壤微生物生物量氮在氯仿熏蒸24 h后，其提取值即達到穩定狀態，但在熏蒸5 d后達到最大值。因此，24 h的熏蒸時間也沿用到土壤MBC的提取和測定[12]。Witt等[13]和Haubensak等[14]的研究結果表明，酸性土壤MBC的提取值在氯仿熏蒸24 h時達到相對穩定，但并非最大值。而Haubensak等[14]與Ross和Tate[15]研究不同熏蒸時間(1 ~ 5 d)對山毛櫸林強酸性表層土MBC值的影響，發現MBC值不會隨著熏蒸時間的增加而發生顯著變化。Haney等[11]研究不同濃度的K2SO4(0 ~ 0.5 mol/L)浸提液對不同pH土壤MBC的浸提影響，發現高pH土壤下不同濃度的K2SO4浸提液的碳提取效率存在波動。同時，考慮到K2SO4溶解度較小的特點，一些研究采用較低濃度的K2SO4浸提液提取MBC。已有的文獻設計的熏蒸時間間隔不均勻且試驗過程中難以維持持續且長久的氯仿蒸汽，并且，堿性土壤中的Ca2+易與浸提液中高濃度SO2– 4離子產生沉淀反應，從而影響提取效率。此外，目前的研究多集中于酸性土壤，而土壤pH是影響K2SO4浸提液提取MBC的關鍵因子之一[11]，因此熏蒸浸提法測定堿性土壤MBC的適用條件還有待研究。本文選取3種不同有機質含量的堿性土壤，采用9種熏蒸時間、2種浸提液濃度對土壤進行MBC的提取、測定和比較，探究不同熏蒸時間和浸提液濃度對熏蒸浸提法測定堿性土壤MBC的影響，以進一步優化堿性土壤MBC的測定方法。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤樣品采自北京植物園及其周邊(39°48′ N，116°28′ E)。根據土壤中有機質的含量，將其分成高有機質土壤(> 40 g/kg)、中有機質土壤(20 ~ 40 g/kg)和低有機質土壤(< 20 g/kg)，土壤基本理化性質見表1。

1.2 土壤樣品采集與預處理

去除土壤表面枯枝落葉層后，每個樣點采集表層土壤，采回土樣放置于-20℃冰箱保存備用。試驗時剔除樣品中可見的動植物殘體和石礫，充分混合均勻后過2 mm篩，分別用于測定土壤理化性質和土壤預培養。

1.3 土壤理化性質的測定

土壤有機質采用硫酸-重鉻酸鉀法測定；pH采用電極法在1∶2.5土水比下測定；全氮采用元素分析儀測定；堿解氮測定采用堿解擴散法測定。

1.4 土壤預培養

將土樣含水量調節至40% 的田間持水量，置于25℃培養箱中預培養一周，同時在培養箱中分別放置盛有水和0.5 mol/L NaOH溶液的燒杯，以保持培養箱中的濕度和吸收微生物呼吸產生的CO2。

表1 土壤理化性質

1.5 試驗設計及土壤MBC的測定

試驗設計如表2所示，共設置18個處理(9個氯仿熏蒸時間×2個浸提濃度)，每個處理3個重復。具體步驟如下：稱取相當于10 g烘干土重的濕土，放入聚乙烯瓶，并置于真空干燥器中，同時放入盛有過量去乙醇氯仿(加入少量沸石)和盛有50 ml 1 mol/L NaOH溶液的燒杯。另外，在干燥器底部放入濕潤的濾紙。干燥器密封后抽真空至氯仿沸騰并保持3 min，關閉干燥器在25℃的黑暗條件下按試驗設計放置相應的時間。待熏蒸結束后，取出盛有氯仿和NaOH的燒杯并反復抽氣，直到土壤中聞不到氯仿氣味為止。隨后分別向熏蒸和未熏蒸土樣中加入0.25 mol/L或0.5 mol/L K2SO4溶液，振蕩30 min(25℃，200 r/min)后用中速濾紙過濾，浸提液保存在-20℃冰箱中待測。用總有機碳分析儀(multi N/C 3100, Analytic Jena AG)測定浸提液中的MBC含量，并用0.45對測定結果進行校正[16]。

表2 不同熏蒸時間和K2SO4浸提液濃度的試驗設計

1.6 數據處理

在IBM Statistics SPSS 18.0中采用檢驗和雙因素方差分析對處理間差異進行顯著性檢驗。

2 結果

2.1 熏蒸時間對MBC提取和測定的影響

對于高有機質土壤(圖1)，在24 h熏蒸處理后，0.25 mol/L K2SO4浸提液提取的MBC值開始增高；隨著熏蒸時間的增長，0.25 mol/L K2SO4浸提液提取MBC值保持穩定；當54 h熏蒸處理時，MBC值達到最大，而60 h熏蒸處理MBC值明顯降低。采用0.5 mol/L K2SO4浸提液提取，在18 h氯仿熏蒸處理后其提取的MBC值開始明顯升高；至24 h時達到較高點，隨后隨著熏蒸時間的增長，MBC值在330 ~ 430 mg/kg波動；當熏蒸時間超過54 h后，MBC值開始降低。因此，建議測定高有機質土壤MBC時熏蒸時間超過24 h。

(A：0.25 mol/L K2SO4；B：0.5 mol/L K2SO4)

對于中有機質土壤(圖1)，在氯仿熏蒸12 h后，0.25 mol/L和0.5 mol/L K2SO4提取MBC值均開始明顯增高，并且分別在18 h和24 h氯仿熏蒸處理后保持穩定；隨著熏蒸時間的增長，MBC值在300 ~ 400 mg/kg波動。因此，測定中有機質土壤MBC建議熏蒸時間超過18 h即可。

對于低有機質土壤(圖1)，在18 h氯仿熏蒸處理后，0.25 mol/L和0.5 mol/L K2SO4提取MBC值都發生波動變化；并且，隨著熏蒸時間的增長，MBC值在80 ~ 120 mg/kg 波動。因此，測定低有機質土壤MBC建議熏蒸時間在24 ~ 30 h。

2.2 浸提液濃度對MBC提取和測定的影響

如表3所示，對高有機質土壤，當熏蒸時間<24 h時，0.25 mol/L K2SO4浸提液提取的MBC值高于0.5 mol/L K2SO4溶液，差異不顯著，但表明0.25 mol/L K2SO4溶液的MBC提取效率更高；當熏蒸時間≥24 h時，0.5 mol/L的K2SO4溶液的MBC提取效率更高，且在24、54、60 h時產生顯著差異(＜0.05)。對中有機質土壤，不同濃度K2SO4浸提液在不同熏蒸時間下MBC提取的效率沒有明顯規律，且僅在熏蒸時間為36 h時，高濃度K2SO4浸提液的浸提效率更高。與中有機質土壤相似，在不同熏蒸時間下，沒有明顯的規律存在于不同濃度K2SO4浸提液對低有機質土壤MBC的提取，且所有的熏蒸時間下提取效率沒有顯著差異。

表3 不同浸提液濃度對土壤MBC的影響

注：表中數據為平均值±標準差；同列不同小寫字母和大寫字母分別表示處理間差異達到＜0.05和＜0.001顯著水平，ns表示處理間差異不顯著。

如表4所示，雙因素方差分析結果表明高有機質土壤中MBC的測定受到熏蒸時間、K2SO4浸提液濃度以及它們之間交互作用的顯著影響(<0.05)；中有機質土壤MBC的測定受到熏蒸時間和熏蒸時間× K2SO4濃度的顯著影響(<0.05)；而低有機質土壤MBC只受到熏蒸時間的顯著影響(<0.001)。

表4 熏蒸時間和K2SO4濃度對土壤MBC影響的雙因素方差分析

注：表中數據表示熏蒸時間和K2SO4浸提液濃度對MBC影響的值，*表示影響達到＜0.05顯著水平，**表示影響達到＜0.01顯著水平，***表示影響達到＜0.001顯著水平。

3 討論

本研究結果表明，堿性土壤最優熏蒸時間和浸提液濃度的選擇與土壤有機質含量有關，熏蒸時間對于不同有機質含量土壤MBC的測定有極顯著效應，K2SO4浸提液濃度對高有機質土壤有極顯著效應。土壤有機質含量越高，MBC值達到穩定的熏蒸時間越長。可能的原因是有機質含量越高，土壤中微生物數量和種類越多，群落更復雜，氯仿蒸汽完全殺死微生物所需的時間也就更長[8]。24 h熏蒸處理后，堿性土壤MBC值達到穩定，但并非最大，與Witt等[13]和Haubensak等[14]在酸性土壤的研究結果一致。隨著熏蒸時間的增長，MBC值發生波動變化是因為熏蒸過程中MBC的含量存在動態平衡。一方面，微生物細胞被氯仿破壞并溶解增加MBC的含量；另一方面，死亡的微生物部分生物量碳被礦化成CO2，同時，未被熏蒸殺死的微生物在新陳代謝中將可溶性生物量碳降解轉化為其他不可溶代謝產物[17-18]。另外，不同微生物類群對氯仿熏蒸時間響應的不同，導致MBC變化的速率不同，從而造成MBC值的波動。此外，熏蒸時間過長導致土壤中的氯仿殘留，也可能引起MBC值產生變化[19]。

K2SO4浸提液濃度顯著影響高有機質土壤的MBC含量，而在較低有機質含量的土壤中，K2SO4浸提液濃度對MBC值的提取沒有顯著影響。高濃度的浸提液有較高的離子強度能夠更多地溶解被氯仿破壞的有機碳，在高有機質土壤中，MBC含量較高，所需的離子濃度越大，因此浸提液濃度會顯著影響MBC的提取和測定；而較低有機質含量的土壤中MBC含量較低，低濃度的浸提液就足夠高效地提取MBC，所以浸提液濃度對MBC的提取和測定沒有顯著影響。同時，熏蒸時間和K2SO4浸提液濃度對于高、中有機質土壤MBC測定存在顯著的交互影響。然而，堿性土壤MBC在提取過程中，Ca2+易在高濃度的K2SO4溶液中形成K2Ca(SO4)2白色沉淀[11]，可能對K2SO4浸提液提取可溶性有機碳造成影響，同時，提取過MBC的溶液易析出白色晶體，可能是因為溫度的變化和K2SO4溶解度較低導致K2SO4晶體析出。因此，更多電解質溶液濃度梯度需要在今后的研究中深入探討。

4 結論

1) 對于堿性土壤，建議測定高有機質土壤MBC時熏蒸時間不少于24 h；測定中、低有機質土壤MBC時熏蒸時間不少于18 h。

2) 土壤有機質含量影響不同濃度K2SO4浸提液的浸提效率，測定高、中有機質土壤MBC需要0.5 mol/L K2SO4浸提液；在低有機質土壤MBC測定中使用0.25 mol/L的K2SO4浸提液即可。在大部分情況下，浸提液濃度對MBC提取效率的影響不顯著，但0.5 mol/L K2SO4浸提液提取的MBC值略高于0.25 mol/L K2SO4浸提液(>0.05)。

3) 在實際科研工作中，在未知土樣有機質含量情況下測定MBC，從熏蒸提取效率和試驗周期綜合考慮，建議堿性土壤氯仿熏蒸時間至少為24 h，K2SO4浸提液濃度為0.5 mol/L。

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Preliminary Study of Fumigation Extraction in Microbial Biomass Carbon of Alkali Soil

LIU Yuqing1,2, ZHU Xiaoqin2, HU Huifeng2*, ZHANG Jinbo1

(1 School of Geography Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China; 2 State Key Laboratory of Vegetation and Environmental Change, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China)

In order to provide the scientific bases for the precise determination of soil microbial biomass (MBC), 9 chloroform fumigation time and 2 K2SO4concentrations were performed to explore the optimal fumigation time and extracted concentration for alkaline soil MBC determination. The results showed that in alkaline soils, fumigation time is significantly correlated with soil organic matter (SOM) concentration. Higher SOM concentration needs longer fumigation time to obtain stable MBC content. Fumigation time for high SOM (≥60g/kg) is at least 24 hours, while that of middle and low SOM (≤30g/kg) is at least 18 hours. SOM concentration influences K2SO4extraction efficiency, the high and middle SOM concentration soils need 0.5 mol/L K2SO4solution to extract, 0.25 mol/L K2SO4solution is enough to extract the MBC contents for low SOM soil. Thus, for a given soil with unknownSOM concentration, the recommended fumigation time and K2SO4concentration is at least 24 h and 0.5 mol/L separately.

Chloroform fumigation; Fumigation time; Alkaline soil; Organic matter; Microbial biomass carbon

國家重點基礎研究發展計劃項目(973計劃)(2015CB954201；2014CB954303)資助。

(huifhu@ibcas.ac.cn)

劉雨晴(1994—)，女，四川攀枝花人，碩士研究生，主要研究方向為土壤生態學。E-mail：yuqingliunjnu@163.com

10.13758/j.cnki.tr.2018.03.028

S154.3

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