乳酸菌的應用及其安全性評價

文│劉少文 何光華 王玲 潘玲 邢成 張曉菊 周曉 （四川省廣元市利州區農業局）

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一類以同型發酵或異型發酵的方式產生乳酸、乙醇、二氧化碳等副產物的革蘭氏陽性細菌的統稱，不含芽孢，微好氧，絕大多數不會運動。乳酸菌廣泛分布于食品或飼料中，可改善食品風味，提高飼料粗蛋白質含量。自然界存在的乳酸菌至少可以劃分為18個屬。分別是：乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、漫游球菌屬（Vagococcus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、腸球菌屬（Enterococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）、片球菌屬（Pediococcus）、肉食桿菌屬（Carnobacterium）、氣球菌屬（A e r o c o c c u s）、奇異菌屬（A t o p o b i u m）、鏈球菌屬（Streptococcus）、糖球菌屬（Saccharococcus）、利斯特氏菌屬（Listeria）、芽孢乳桿菌屬（Sporolactobacilus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）的少數種、環絲菌（Brochothrix）、明串珠球菌（Leuconostoc）、丹毒絲菌屬（Erysipelothrix）和孿生菌屬（Gemella）等。其中，應用于食品、飼料、醫藥等行業的乳酸菌菌株主要有乳球菌（Lactococcus）、腸球菌（Enterococcus）、糞腸球菌（Enterococcus,faecalis）、酒球菌（Oenococcus）、片球菌（Pediococcus）、鏈球菌（Streptococcus）、明串珠菌（Leuconostoc）、乳桿菌（Lactobacillus）等。

隨著分子生物學技術的發展，人類開始利用基因手段對乳酸菌進行分類鑒定。1995年，Fleischman等人首次采用全基因組鳥槍法測序（wholegenome shotgun sequencing）對嗜血流感菌（H a e m o p h i l u s influenzae）進行測定并獲得成功。2001年，第一株乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp.lactisIL1403）全基因組測序宣告完成。截止至今，已有數十種乳酸菌的全基因組獲得了測序數據，其中包括：Lactobacillus acidophilusNCFM、Lactobacillus brevisATCC367、Lactobacillus caseiATCC334、Lactobacillusdelbrueckii bulgacricusATCCBAA365、Lactobacillus gasseriATCC33323、Lactobacillus johnsoniiNCC533、Lactobacillus plantarumWCFS1等。這無疑有助于人類從本質上了解乳酸菌的進化、功能特點以及與環境之間的關系，進而使乳酸菌在食品和飼料行業中得到合理應用。同時，期待著從基因水平來揭示乳酸菌的具體代謝機制，加速菌株選育和改造，優化食品、飼料發酵條件，使工業乳酸菌的風險降低至零。

一、乳酸菌基因組的研究進展

乳酸菌基因組的大小大多在1.8～3.2 Mb，但干酪乳桿菌ATCC334的基因組相對比較大，為3.35 Mb，表明乳酸菌可能處于動態進化過程中。乳酸菌的鳥嘌呤G和胞嘧啶C含量較低，不超過55%，大多數集中在30.8%～50%，其中，唾液乳桿菌UCC118C＋G含量只有33%，但雙歧桿菌含量高達60.1%。乳酸菌細胞中含有大小不等的質粒，其編碼基因數量在基因組中所占比例一般不超過5%，大小在2～242 kb之間。乳酸菌基因組中含有rRNA操縱子和tRNA編碼基因，它們是基本功能基因。rRNA操縱子排列具有一定順序性，通常為16s rRNA，23s rRNA，5s rRNA，而且在它們周圍常常會出現tRNA Ile，tRNAAla，tRNALys等編碼基因。tRNA編碼基因數量為43～98個。乳酸菌基因組中還含有一些與代謝相關的重要基因：WCFS1基因編碼糖酵解途徑和磷酸乙酮醇途徑的相關酶系，參與糖代謝；Nisin基因編碼自溶性細菌素；EPS基因簇參與細胞表面多糖的合成；Mub基因編碼黏膜結合蛋白。這類基因在乳酸菌的生命代謝中扮演著十分重要的角色，深入其研究有助于我們將乳酸菌的益生功能與基因克隆聯系起來，再運用到食品風味改良、生物蛋白飼料中去。

此外，質粒編碼基因和噬菌體編碼基因是乳酸菌的特殊功能基因。乳酸乳球菌ssp可編碼5種質粒，編碼基因多達129個，而嗜熱鏈球菌可編碼兩個質粒，編碼基因僅為6個。德氏乳桿菌的質粒是一個環狀的DNA分子，含有6個ORF結構，編碼3種膜鑲嵌蛋白，GC含量為44.6%。噬菌體編碼基因在乳酸菌中含量較少，僅為1～2個。所有的乳酸菌都含有假基因，不能合成功能蛋白質，但在菌體整個生命周期中可能起著后補基因的作用。由于基因漂移現象，乳酸菌中還存在一些未知功能基因，盡管有時表現出某些酶的活性，但卻不易識別其完整的生理功能。如要實現乳酸菌的安全生產，對未知基因的深入研究很有必要。

二、食品、飼料行業中的乳酸菌

乳酸菌能夠分解食品中的碳水化合物，合成維生素，對脂肪也有部分分解作用，顯著提高食品消化利用率。乳酸菌發酵產生的有機酸能夠促進微量元素如鈣、鐵、磷等的吸收。另一方面，乳酸菌主要作為微生物添加劑進入配合飼料中可以提高動物生產性能（表1）。其主要機制包括：改善動物腸道組織微循環，作為益生菌抑制和吸附病原菌，通過發酵產生適量乳酸提高飼料適口性、改善風味等。

21世紀以來，畜牧業發展對乳酸菌需求量日趨提高。研究表明，乳酸菌發酵食品營養價值較高，感官風味優良，幾乎1/4的發酵食品都有乳酸菌參與；發酵飼料具有無污染、無殘留、不產生耐藥性等特點。食品和飼料中天然存在或外源添加的乳酸菌種類見表2。

表1 乳酸菌在動物生產中的有益作用

三、乳酸菌的安全性研究

1.代謝產物的毒害性。國內外大量研究表明，乳酸菌發酵后會產生一些有毒害作用的代謝產物，如D-乳酸、亞硝酸鹽、生物胺類、吲哚等。這類物質如果在畜禽和人類體內中蓄積過多，將導致致病性。例如：人體內的乳酸脫氫酶幾乎全為L型，D型含量極少，一旦D-乳酸在機體內產生過量時，D-乳酸脫氫酶能完全將其分解，這將導致短腸綜合征（short bowels syndrome）發生。研究表明，嬰幼兒更不適合使用產D-乳酸的乳酸菌。乳酸菌能夠利用其硝基還原酶將食物中過量的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽等致癌物質，這提示含硝酸鹽過多的食品和飼料（尤其是食品）有致病風險。一些乳桿菌能夠將食品或飼料中的氨基酸脫羧還原生成生物胺類物質，這類物質在體內聚集過多會導致中毒癥狀。同時，乳酸菌的氨基脫羧酶也參與亞硝酸鹽的生產過程。吲哚試驗可以證明乳酸菌代謝會產生吲哚，這類雜環類化合物長期大量蓄積體內會使機體免疫力下降，動物生產性能降低。此外，乳酸菌毒性代謝產物還包括溶血素、溶細胞素、腸毒素等。Duc等的研究表明，在市場上銷售的3株益生菌能夠產生溶血素和腸毒素，被人體服用后產生不安。飼料工業已認可的益生菌也不多，主要是乳酸桿菌、芽孢桿菌、雙歧桿菌等少數菌種。可見，乳酸菌在食品、飼料等行業上的投入應用還需謹慎。

2.細菌易位。國內外雖然很早就有關于腸道微生態失調方面的研究，但是在細菌易位（bacterialtranslocation， BT），尤其是乳酸菌易位方面的研究甚少。筆者查閱近十年國內外文獻發現，乳酸菌等益生菌在細菌易位方面主要起著抑制內毒素和病原菌如大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（P.Aeruginosa）、克雷白桿菌屬（Klebsiella）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacea）等促進作用，但乳酸菌本身也會發生易位。例如，正常情況下，宿主動物體內存在的乳酸菌主要是Lb.acidophilus、Lactobacillus murinus、Lactobacillus intestinalis、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus agilis、Lactobacillus ruminis、Lactobacillus vitulinus、Lactobacillus hamsteri、Lactobacillus aviaries、Lb. casei、Lactobacillus reuteri和Lb.brevis。乳酸菌在口腔和回腸中菌體數量為103～107CFU/克，結腸中乳酸菌數量達104～108CFU/克，乳酸菌也是陰道的主要定植細菌。然而，當腸道細菌過度繁殖、腸黏膜屏障受損和機體免疫防御功能低下時，乳酸菌可能會突破腸壁侵入機體引發炎癥，發生易位現象，但易位的具體機制目前尚不清楚。其易位途徑主要有2條：一是經腸系膜靜脈匯入門靜脈入肝而到體循環和全身其他器官；二是經腸系膜淋巴結匯入胸導管，繞過肝臟直接進入體循環和其他器官組織。

表2 食品和飼料中常見的乳酸菌種類

細菌易位致病幾率增加的一些危險因素，主要有：免疫抑制和新生兒早產。次要因素包括：腸上皮受損、中心靜脈導管的插入、空腔造口術乳酸菌的攝入、抗生素濫用、心血管病。乳酸菌易位容易引起臨床感染，最常見的是心內膜炎，菌血癥以及局部性感染如膿腫。CANNON等統計1950-2003年的241例乳酸菌引起的臨床感染病例，141例已明確鑒定到屬，其中L.casei50例，L.rhamnosus32例，由單一乳酸菌引發172例，多種乳酸菌的復合感染69例。

3.抗生素抗性。研究表明，乳酸菌中大多數抗生素抗性基因是不會轉移的，但與結合質粒、轉座子相關的抗性基因會發生轉移，從而引起機體耐藥性。乳酸菌中結合轉座子抗性基因長度不超過70kb，但也大于16kb。

目前，與食品/飼料有關乳酸菌抗生素抗性基因如下：Lb.reureriG4菌株抗性基因為cat（chloram phenicol acetylase gene）基因；Lc. lactis strainK214菌株抗性基因為Str-tet（S）-cat基因；Lb. plantarum5057菌株抗性基因為tet（M）（tetracycline resistance gene）基因；Lb.johnsonii菌株抗性基因為Laf I基因等。乳酸菌中存在抗四環素和抗紅霉素基因的比例高達62%。與此同時，SCOTT推斷在腸道菌群之間、腸道菌群和病原菌之間存在著基因的水平轉移。乳球菌、腸球菌和乳桿菌對四環素（Tetracycline）、紅霉素（Erythromycin）和萬古霉素（Vancomycin）存在抗性基因，可能將抗性基因轉移給腸道內的其他原籍菌或是致病菌，如腸球菌可以將慶大霉素基因（Gentamicin gene）轉移給葡萄球菌?？剐曰虻霓D移可以通過未經加熱處理的發酵奶制品、發酵肉制品、粉狀配合飼料來傳播。HUYS從歐洲奶酪中分離到抗四環素的腸球菌，并從中分離到最突出的轉座子Tn916-Tn1545，該轉座了帶有tet（M）基因，其抗性基因的轉移率為10-9～10-6。

一般來講，野生型抗藥乳酸菌不會發生抗藥基因的轉移，然而，基因突變菌株或后天獲得性抗性菌株很容易通過質粒或轉座子將抗生素抗藥基因轉移給其他菌株。如果突變乳酸菌生長在抗生素存在的環境下，那么，抗性基因就更有可能轉移到其他種屬，后果將更加嚴重。因此，為有效控制乳酸菌的抗性基因通過食物鏈（生態鏈）轉移，可以將食品原料或飼料原料進行巴氏消毒或加熱處理。

4.基因工程菌。基因工程乳酸菌在食品和飼料行業已應用很多年，在食品發酵、飼料青貯過程中，乳酸菌的質粒DNA已經顯示出其重要的生物功能。如乳酸球菌肽的啟動子nis A的可調控表達系統（NICE-System，Nisin incontrol expression system）通過表達系統能夠調節誘導乳酸球菌肽的分子，在分子水平上控制誘導劑和乳球菌肽的比例，從而嚴格控制外源蛋白的表達量，在一定的范圍內誘導效率增加千倍以上。RAVINV 等通過對德氏乳桿菌和保加利亞乳桿菌亞種中噬菌體的高頻質粒轉導研究發現，基因重組技術可以減少噬菌體的增殖。HUO等將纖維素酶基因CBH II與表達載體Pet30a進行重組，構建了pETCB H，再將構建好的質粒轉化至Rosetta宿主菌，利用異丙基硫代半乳米酯IPTG誘導重組菌株，檢測重組纖維素酶的活性為2.677單位/毫升。

近幾年，隨著新型乳酸菌菌株的分離應用和重組基因工程乳酸菌的出現，使得基因工程乳酸菌的安全問題顯得尤為重要。特別是應用于飼料和食品中的重組基因工程乳酸菌，其潛在的致病性、抗藥基因轉移造成的感染、致病性細菌的過度繁殖和變異無法控制性等已經引起了國內外專家的緊密關注。其次，工程菌抗性基因的安全性也有待研究。例如，能提供同一抗生素抗性的基因往往不止一個，如卡那霉素抗性基因有十多個，編碼產物的結構差異較大，npt II可安全使用，其他卡那霉素抗性基因是否安全尚需進一步分析。另一方面，盡管已經實現了抗原基因在基因工程菌中的表達和保護作用，重組菌長期在消化道內表達的抗原蛋白能否引起機體免疫耐受也是值得考慮的安全問題。由于乳酸菌的種屬很多，不同種屬之間菌株的生化特性、分子構成和免疫特性均不相同，因此在構建重組工程菌時，應根據研究目的不同而選擇合適的宿主菌株。

四、乳酸菌的安全性評價

近年來，隨著國內外學者對食品、飼料生產用乳酸菌的研究不斷深入，應運而生的乳酸菌產品日益增多，產品的安全狀況越來越引起公眾的關注，對生產用乳酸菌安全性的評價也已成為生產企業和政府部門關注的焦點。然而，中國尚未出臺配套的乳酸菌安全性評價標準，評價方法主要參照國際上關于乳酸菌安全性評價程序。乳酸菌的安全性評價主要包括兩方面內容：菌體鑒定和毒理學評價。

乳酸菌鑒定是評價其安全性的第一步，可初步預測某種屬的菌株是否可以完全投入生產。目前，部分微生態產品標簽上標注的信息與從益生菌產品中分離得到的微生物的鑒定結果與并不完全相符。如某調查項目顯示，市場上28%的商業益生菌發酵劑的鑒定結果是錯誤的，這主要源于生產者和經銷商對菌株的錯誤鑒定。乳酸菌鑒定分為表觀形態鑒定和分子水平鑒定。乳酸菌顯微形態觀察指標主要有革蘭氏染色、細胞形態、運動性、是否有芽孢、鞭毛等。另外，近年來研制成功的多種有益菌的糖類生化反應板，已使生化鑒定從原來的復雜繁瑣變得簡單易行，便于推廣。然而，僅憑表觀指標不能準確鑒定乳酸菌，還需從分子層次進一步確認。如PCR法、隨機擴增多態性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA RAPD）法、DNA的G+C含量測定法、DNA/DNA雜交技術、16S RNA序列測定、DNA-DNA同源性分析法、細菌DNA限制性核酸內切酶分析法、系統發育學研究rRNA同源性分析法及其他可靠的遺傳學鑒定方法。這類方法著眼于乳酸菌特定的DNA片段或核苷酸含量，從基因水平入手以便獲得準確的鑒定結果。

對用于食品、飼料工業上的乳酸菌而言，其安全性至關重要。因此，毒理學評價必不可少。國際上毒理學評價乳酸菌安全性主要包括：動物急性毒性試驗，30天喂養試驗及三項致畸突變試驗。耐藥性評價試驗，主要指抗生素敏感試驗和耐藥基因檢測。致病基因與代謝產物的毒性檢測；如屎腸球菌的毒性基因efaAfm基因檢測、代謝毒物溶血素、溶細胞素、腸毒素和D-乳酸等的含量變化。機體指標評價試驗包括：丙二醛（MDA）血清濃度監測和谷胱甘肽（GSH）濃度監測、膽鹽羥化酶活性監測等。其他評價，包括溶血試驗、細菌易位等。

中國尚未制定關于乳酸菌的安全性評價準則，但根據國際上對乳酸菌的安全性評價準則，乳酸菌安全性評價主要集中在毒理學評價、耐藥性評價、機體評價指標、有害代謝產物評價和其他評價。體外試驗和動物喂養試驗基本確定乳酸菌的安全性之后，再進行人體試驗。例如多項動物試驗研究結果表明，在治療小兒腹瀉時，服用乳酸菌素或乳酸菌膠囊療效顯著，且治療過程中未發現任何不利影響。

五、結論

乳酸菌是革蘭氏陽性細菌的統稱，自然界存在的乳酸菌至少可以劃分為18個種屬，均廣泛分布于食品或飼料中，是重要的工業微生物。有關乳酸菌基因組學的報道在國內外已取得一定的進展。其次，對特殊基因的研究有助于從更微觀的角度去認識乳酸菌?？傮w而言，乳酸菌對人類的健康和食品、飼料工業發展是有益的，但也不能忽視乳酸菌可能導致的潛在危害。如代謝產物的毒害性、細菌易位、抗生素抗性以及基因工程菌等可能帶來的風險。因此，對乳酸菌乃至益生菌的安全性評價顯得尤其重要，相信隨著研究地不斷深入，乳酸菌的安全性評價將逐步趨于標準化、全球化。