大鼠背根神經節細胞中TRPV1與cAMP/PKA通路調控機制研究

高 峰，盧偉龍，王華林，吳媛媛，王 斌，李 敏

(陜西中醫藥大學藥學院，陜西 西安 712000)

瞬時受體電位通道(transient receptor potential canonical，TRP)是一類重要的陽離子通道。辣椒素受體(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)是TRP家族通道蛋白之一，為熱敏感蛋白，可被高于42℃的溫度、炎癥、疼痛、辣椒素等體內多種因素激活[1-2]，主要存在于中樞神經系統及末梢神經系統上。TRPV1目前在疼痛、炎癥、中醫寒熱病證、中藥寒熱藥性等方面有重要意義[3-4]。TRPV1蛋白后期的磷酸化對其功能的發揮至關重要，有研究表明，cAMP/PKA通路可促進TRPV1的磷酸化，使其激活[5-6]。另有研究發現，TRPV1活化后，促進cAMP含量升高[3]，兩者之間的調控作用尚不明確。課題組前期研究表明，體內cAMP/PKA信號通路的磷酸化水平與TRPV1的蛋白表達有一定相關性[7]。因此，本研究通過體外細胞實驗，分別應用兩者的激動劑和抑制劑干預，進一步探討TRPV1與cAMP/PKA信號通路之間的調控作用。

1 材料

1.1實驗動物新生大鼠購自第四軍醫大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(軍)2012-0007。

1.2試劑胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、DMEM/F12培養基購自Hyclone；TRIzol(貨號15596-026)購自無錫菩禾；逆轉錄試劑盒(貨號#K1622)購自Thermo公司；cAMP/PKA信號通路激動劑8-Br-cAMP(貨號ab141449)、抑制劑H-89(貨號ab143787)、TRPV1激動劑辣椒素capsaicin(貨號ab140100)、抑制劑i RTX(貨號ab146031)，均購自Abcam公司。

1.3儀器Thermo Scientific 8000細胞培養箱(美國賽默飛世爾公司)；XDS-1A光學顯微鏡(上海精密儀器儀表有限公司)；DMI3000B倒置拍照顯微鏡、TCS SP5 II共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)；ABI-7500 Real-time檢測儀(ABI公司)；Mini protean 3 cell電泳儀(美國Bio-Rad公司)；ChemiScope一體式化學發光成像儀(上海勤翔科學儀器有限公司)。

2 方法

2.1大鼠背根神經節(dorsalrootganglion，DRG)細胞的分離與鑒定參考文獻[8]，新生大鼠注射15%水合氯醛處死，放入低溫的DMEM不完全培養液，大鼠死后，快速分離脊髓，摘取DRG并剪碎，放入含膠原酶的DMEM/F12培養基中60～90 min。再置于含0.125%胰蛋白酶的磷酸緩沖鹽 (phosphate buffer saline，PBS)溶液中15 min。用含10% FBS的DMEM/F12培養基終止消化，獲取的細胞接種于神經細胞完全培養基中，d 2換液繼續培養。細胞傳代24 h，4%多聚甲醛固定，加入神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)，室溫封閉15 min。加入對應二抗，37℃孵育1 h，洗滌，Hoechst 33258染液，室溫避光孵育30 min。細胞于熒光顯微鏡下觀察，隨機計數10個視野中細胞總數和β-tubulin Ⅲ的染色陽性細胞數，計算百分比，表示細胞純度。

2.2MTT法檢測8-Br-cAMP、H-89、capsaicin、iRTX對大鼠DRG細胞的影響大鼠DRG細胞生長至對數生長期，以5×107·L-1濃度接種至24孔細胞培養板，37℃、5% CO2培養24 h。分為正常對照組、8-Br-cAMP組(200、100、50、25、12.5、6.25 μmol·L-1)、H-89組(160、80、40、20、10、5 μmol·L-1)、capsaicin組(80、40、20、10、5、2.5 μmol·L-1)、i RTX組(16、8、4、2、1、0.5 μmol·L-1)，分別加入含藥的無血清培養基，每孔加100 μL，設4個復孔，培養48 h，每孔加MTT溶液 20 μL，孵育4 h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液。每孔加150 μL DMSO，微量振蕩器振蕩10 min，使結晶物充分溶解，選擇570 nm波長，酶標儀測定各孔光吸收值。

2.38-Br-cAMP、H-89、capsaicin、iRTX對大鼠DRG細胞TRPV1、p-PKA作用研究大鼠DRG細胞以5×107·L-1濃度，接種于12孔板，分正常對照組(control)、8-Br-cAMP 50 μmol·L-1組、H-89 20 μmol·L-1組、capsaicin 25 μmol·L-1組、i RTX 2 μmol·L-1組，每組設4 個復孔，重復3次，培養48 h 后收集細胞，檢測TRPV1、p-PKA基因、蛋白表達。

2.48-Br-cAMP、H-89、capsaicin、iRTX對大鼠DRG細胞TRPV1、p-PKAmRNA表達的影響定量PCR檢測TRPV1、p-PKA mRNA，所需的引物序列見Tab 1。①RNA的抽提；②逆轉錄cDNA：逆轉錄反應體系的配制；將試劑盒從-80℃冰箱取出，復溶，將5×逆轉錄buffer、dNTPs、 oligo(d T) 10 000 r·min-1，數秒。將經過稀釋后的RNA樣本進行定量PCR檢測。mRNA表達的數據采用儀器自帶軟件ABI Prism 7500 SDS Software分析。PCR擴增后，實時熒光定量PCR儀自動分析結果，根據陰性對照調整閾值和基線以確定各標本的Ct值，并根據熔解曲線確定該Ct值是否有效。將結果導出，采用2-△△CT法分析目的基因在對照組和各濃度組之間的表達差異，計算公式如下：△Ct= Ct目的基因-Ct內參，再求得對照組△Ct的平均值，記為△Ct對照平均，用各組的△Ct分別減去△Ct對照平均，求得△△Ct值，即△△Ct=△Ct樣本-△Ct對照平均，再計算各組2-△△CT值，即為各組中基因的相對表達量。

Tab 1 Required primer sequence

2.58-Br-cAMP、H-89、capsaicin、iRTX對大鼠DRG細胞TRPV1、p-PKA蛋白表達的影響收集細胞，每組分別加入500 μL的RIPA裂解液，并加入適量的PMSF，置冰上裂解2 h；4℃、12 000 r·min-1離心10 min；移上清于新的EP管中，進行蛋白質定量后貯存于-20℃冰箱。蛋白定量后，SDS-PAGE電泳、轉膜。膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，每次10 min。加入相應二抗，與膜37℃孵育1 h。用TBST洗滌3次，每次10 min。顯色，一體式化學發光儀拍攝照片。蛋白表達水平用目的條帶積分吸光度值(integrated absorbance，IA) 與內參 β-actin條帶的 IA 比值表示。

3 結果

3.1DRG神經元形態學特征Fig 1相差顯微鏡觀察，可見DRG細胞神經元胞體有一定透亮度和折光性，突起分支十分茂密，可見少量神經膠質細胞及細胞碎片，少量非神經元細胞核。DRG神經元純度結果顯示，DRG神經元β-tubulin Ⅲ陽性細胞比例達到81%，細胞分離培養效果良好。

3.28-Br-cAMP、H-89、capsaicin、iRTX對大鼠DRG細胞的影響由Tab 2可知，與正常對照組比較，8-Br-cAMP 200 μmol·L-1、H-89 160 μmol·L-1、capsaicin 200 μmol·L-1、i RTX 16、8 μmol·L-1使細胞增殖明顯降低(P<0.05，P<0.01)，故選擇8-Br-cAMP 50 μmol·L-1、H-89 20 μmol·L-1、capsaicin 25 μmol·L-1、i RTX 2 μmol·L-1對細胞沒有損害的濃度作為后續實驗濃度。

3.38-Br-cAMP、H-89、capsaicin、iRTX對TRPV1、p-PKAmRNA表達的影響Tab 3結果顯示，與正常對照組比較，8-Br-cAMP、capsaicin可明顯促進TRPV1 mRNA的表達(P<0.01)，i RTX可明顯降低TRPV1 mRNA表達(P<0.01)，H-89對TRPV1 mRNA表達的影響不明顯；8-Br-cAMP可促進p-PKA mRNA的表達，H-89可降低p-PKA mRNA表達(P<0.05)；capsaicin、i RTX對p-PKA mRNA表達的影響不明顯。

Fig 1 Dorsal root ganglion cells of rats(scale bar=50 μm)

Tab 2 Cell proliferation rate in each

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Tab 3 Expression of TRPV1 and p-PKA mRNA

GroupDose/μmol·L-1TRPV1p-PKAControl-1.00±0.021.00±0.038-Br-cAMP501.17±0.03**1.21±0.01**H-89200.99±0.030.81±0.01*Capsaicin251.17±0.02**1.02±0.03i RTX20.80±0.02**1.01±0.02

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.48-Br-cAMP、H-89、capsaicin、iRTX對p-PKA、TRPV1蛋白表達的影響與正常對照組比較，8-Br-cAMP、capsaicin可明顯促進TRPV1蛋白的表達(P<0.01)，i RTX可明顯降低TRPV1蛋白表達(P<0.05)，H-89對TRPV1蛋白表達的影響不明顯；8-Br-cAMP可促進p-PKA蛋白的表達，H-89可降低p-PKA蛋白表達，差異均有統計學意義(P<0.05)；capsaicin、i RTX對p-PKA蛋白表達的影響不明顯(Fig 2)。

4 討論

TRP是一類重要的陽離子通道，在TRP通道中，感受溫度變化及參與體溫調節的有多個家族和通道蛋白，其中熱敏感通道蛋白TRPV1分布廣泛，是具有多功能的細胞感受器。TRPV1可被體內外多種物理化學因素激活，如傷害性熱刺激、低pH值(酸性環境)、炎癥、疼痛、辣椒素等。在疼痛的感知與調節、體溫感知與調節、炎癥的發生及中醫寒熱病證、中藥寒熱藥性等方面研究中，TRPV1起著重要作用[7]。因此，探討TRPV1體內的調控機制，有非常重要的意義。在TRPV1的活化中，磷酸化起著重要作用。Schnizler等[9]證實，PKA磷酸化作用增敏TRPV1通道由A激酶錨定蛋白AKAP150 所介導。Bhave等[10]在轉染TRPV1的cos7細胞中，給予辣椒素連續刺激后，產生急性脫敏現象；用8-Br-cAMP溫育cos7細胞后，再給予辣椒素刺激，無急性脫敏現象；將PKA抑制劑與8-Br-cAMP一起溫育cos7細胞，辣椒素刺激后，脫敏現象重新出現。還有研究表明，TRPV1的增強可促進cAMP的含量。可見cAMP/PKA信號通路引發的細胞磷酸化與TRPV1活化之間關系密切，TRPV1生理病理功能與cAMP/PKA通路的調控相關聯。課題組前期研究表明，辛熱藥提高虛寒機體TRPV1活性同時，可上調機體cAMP/PKA信號通路。本實驗從體外進一步探討體內cAMP/PKA信號通路與TRPV1的調控關系，對TRPV1相關病癥的研究有重要作用。

Fig 2 Expression of p-PKA, TRPV1 in different groups

1: Control;2: 8-Br-cAMP(50 μmol·L-1);3: H-89(20 μmol·L-1);4: Capsaicin(25 μmol·L-1);5: i RTX(2 μmol·L-1).*P<0.05，**P<0.01vscontrol.

實驗中采取膠原酶、胰酶消化分離DRG細胞的方法較為成熟，分離出的細胞形態較為完整，活性較強，純度較高。應用cAMP/PKA通路激動劑8-Br-cAMP、抑制劑H-89和TRPV1的激動劑辣椒素、抑制劑i RTX進行干預。實驗結果表明，8-Br-cAMP 和H-89可明顯上調或降低p-PKA基因、蛋白表達；capsaicin、i RTX可明顯上調或降低TRPV1基因、蛋白表達；capsaicin、i RTX對p-PKA基因、蛋白的表達無明顯影響，8-Br-cAMP可促進TRPV1的基因、蛋白的表達，H-89則對TRPV1的基因、蛋白的表達無明顯影響。可見，TRPV1的激活或抑制對cAMP/PKA信號通路無明顯影響，而cAMP/PKA信號通路激活可活化TRPV1，cAMP/PKA信號通路抑制時，對TRPV1基因、蛋白表達影響不大，可能除了cAMP-PKA信號通路可調控TRPV1的表達外，還存在其他信號通路對TRPV1也有一定調控作用，具體的調控機制還需在后期進一步深入研究。

(致謝：本實驗在陜西中醫藥大學醫學實驗中心完成，感謝參與完成實驗的課題組成員。)